血小板生成素受體(Mpl)胞外區(qū)與TPO、hNUDC關(guān)鍵結(jié)合氨基酸位點(diǎn)的研究.pdf

1、血小板是哺乳動(dòng)物血液中的重要細(xì)胞成分之一，主要起凝血作用。大量的研究數(shù)據(jù)表明，血小板生成素(TPO)是血小板形成過程中一個(gè)最重要的細(xì)胞因子。但有研究結(jié)果顯示TPO并不是必不可缺，在TPO基因敲除小鼠中，巨核細(xì)胞和血小板減少85％，但小鼠仍然正常發(fā)育，這提示還有其它的代償機(jī)制，或有未發(fā)現(xiàn)的其他配體蛋白在血小板缺失的情況下替代TPO的作用。本實(shí)驗(yàn)室曾用血小板生成素受體胞外區(qū)域(Mpl-EC)為釣餌，從人體胎兒肝臟cDNA文庫中篩選出與血小板

2、生成素受體(Mpl)互相作用的新配體蛋白—hNUDC(humannuclear distribution protein C，hNUDC)。通常認(rèn)為，NUDC在哺乳動(dòng)物細(xì)胞僅行使核遷移的功能，但是本實(shí)驗(yàn)室前期的結(jié)果表明，hNUDC與Mpl有較強(qiáng)的結(jié)合，并通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀(IP)的研究方法，將TPO、hNUDC兩個(gè)配體與受體Mpl-EC的結(jié)合區(qū)域確定在Mpl-EC-D1(102-251 aa)區(qū)域。
　　 本論文以上

3、述研究為基礎(chǔ)，進(jìn)一步深入地研究兩配體TPO或hNUDC與受體Mpl的具體結(jié)合部位。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求，需要純度較高且數(shù)量較大的TPO、hNUDC蛋白質(zhì)作為研究材料。為了滿足實(shí)驗(yàn)的需要，我們分別采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)一二氫葉酸還原酶擴(kuò)增系統(tǒng)(CHO-dhfr-)來表達(dá)兩種配體蛋白。通過優(yōu)化一系列誘導(dǎo)表達(dá)條件，成功地表達(dá)了hNUDC，蛋白表量可達(dá)500μg/L，但未能成功表達(dá)TPO蛋白。為此，我們使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

4、——二氫葉酸還原酶擴(kuò)增系統(tǒng)(CHO-dhfr-)來表達(dá)兩種配體蛋白。通過酸鈣法將構(gòu)建好的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pCDNA3.1-TPO-His和pCDNA3.1-TS-hNUDC-His，分別與pSV2-dhfr載體共轉(zhuǎn)染到二氫葉酸還原酶缺陷型細(xì)胞系(CHO-dhfr-)。經(jīng)過G418抗性及培養(yǎng)基營養(yǎng)缺陷篩選，得到了能夠高效分泌表達(dá)TPO-His蛋白和hNUDC-His的穩(wěn)定系。表達(dá)得到的蛋白采用Ni親和層析一步法純化，純度可達(dá)95％以上

5、。BCA法測(cè)定兩種配體蛋白的濃度，并估算其表達(dá)量，TPO-His為2.8μg/106cells/24h，hNUDC-His為1.5μg/106cells/24h。
　　 了進(jìn)一步定位Mpl-EC(102-251 aa)與兩配體TPO或hNUDC結(jié)合的最小區(qū)段，先以EBP晶體結(jié)構(gòu)為模板，模建得到Mpl-EC-Dl的3D結(jié)構(gòu)。再根據(jù)受體3D結(jié)構(gòu)模型，將Mpl-EC-D1(102-251 aa)分成5小段，并將其cDNA分別克隆到噬菌

6、體載體中，最終以噬菌體衣殼蛋白的形式展示在噬菌體表面。然后分別用ELISA篩選能與兩配體有效結(jié)合的噬菌體。結(jié)果，Mpl-EC-D1(206-251 aa)區(qū)段是TPO和hNUDC共同的有效結(jié)合微區(qū)域。為進(jìn)一步闡明兩配體與受體結(jié)合的具體氨基酸位點(diǎn)。通過一系列丙氨酸置換突變的工作，突變了15個(gè)相關(guān)氨基酸位點(diǎn)，通過噬菌體ELISA結(jié)合分析，得到位于Mpl-EC-D1(206-251 aa)兩個(gè)疏水性氨基酸Lue-228和Lue-230對(duì)hNU

7、DC與受體的結(jié)合有重要作用；而Asp-235和Leu-239對(duì)TPO與受體的結(jié)合起關(guān)鍵作用。另外，為了證明WGSWS保守序列與TPO或hNUDC結(jié)合是否有關(guān)，本論文將WGSWS進(jìn)行缺失突變后，分別于兩配體進(jìn)行了結(jié)合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，和野生型相比較，缺失突變WGSWS的受體與hNUDC結(jié)合下降19％，而該突變對(duì)TPO與受體的結(jié)合影響并不顯著。
　　 總之，本論文利用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)(CHO-dhfr-)成功篩選得到高效分泌表達(dá)TPO