根尖周感染的根管微生物生態(tài)學(xué)研究.pdf

1、第一章根尖周感染的根管內(nèi)細(xì)菌多樣性及系統(tǒng)發(fā)育分析
　　 研究目的：
　　 通過(guò)16S rRNA基因克隆文庫(kù)技術(shù)和限制性內(nèi)切酶PCR-RFLP指紋圖譜分析慢性根尖周炎初次感染和根管治療后持續(xù)感染根管內(nèi)細(xì)菌群落的組成情況，了解根管內(nèi)細(xì)菌群落構(gòu)成的多樣性特征。
　　 材料方法：
　　 收集慢性根尖周炎初次感染和根管治療后持續(xù)感染病例，提取細(xì)菌總DNA，采用通用引物PCR擴(kuò)增細(xì)菌的16S rRNA基因，構(gòu)建克隆文

2、庫(kù)，通過(guò)HaeⅢ限制性內(nèi)切酶對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因文庫(kù)中的克隆進(jìn)行PCR-RFLP限制性酶切片段長(zhǎng)度多樣性分析，將所有陽(yáng)性克隆分為若干個(gè)可操作分類單元(OTU)，選取代表克隆測(cè)序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
　　 結(jié)果：
　　 構(gòu)建了三個(gè)慢性根尖周炎初次感染和兩個(gè)根管治療后持續(xù)感染的16S rRNA基因克隆文庫(kù)。
　　 對(duì)于根管初次感染的16S rRNA基因克隆文庫(kù)，經(jīng)PCR-RFLP圖譜分析后代表測(cè)序的251個(gè)克隆中

3、，共獲得50類細(xì)菌，歸屬于5個(gè)細(xì)菌類群的24個(gè)細(xì)菌屬別，其中26類(52％)為未獲培養(yǎng)的細(xì)菌類別，有2類細(xì)菌為以前研究中未報(bào)道過(guò)的新類別。厚壁菌門(42％)和擬桿菌門(34％)的細(xì)菌種類最多。細(xì)菌分布具有個(gè)體差異性，主要優(yōu)勢(shì)菌包括普氏菌、牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、Solobacterium moorei、月形單胞菌、小桿菌、彎曲桿菌和消化鏈球菌。
　　 對(duì)于根管持續(xù)感染的16S rRNA基因克隆文庫(kù)，經(jīng)PCR-RFLP圖譜分析

4、后代表測(cè)序的179個(gè)克隆中，共獲得30類細(xì)菌，細(xì)菌種類和數(shù)量較初次感染減少，菌群構(gòu)成也與初次感染不同，歸屬于5個(gè)細(xì)菌類群的11個(gè)細(xì)菌屬別，其中14類(46.7％)為未獲培養(yǎng)的細(xì)菌類別，有1類細(xì)菌為以前研究中未報(bào)道過(guò)的新類別。螺旋體門(33.3％)和擬桿菌門(26.7％)的細(xì)菌種類最多。細(xì)菌分布具有個(gè)體差異性，主要優(yōu)勢(shì)菌包括密螺旋體、牙齦卟啉單胞菌、普氏菌、大腸桿菌和韋榮球菌，其他檢出的細(xì)菌還包括產(chǎn)線菌，具核梭桿菌，牙齦二氧化碳嗜纖維菌，

5、纖毛菌和奈瑟氏菌。
　　 結(jié)論：
　　 慢性根尖周炎初次感染和根管治療后持續(xù)感染是由多種厭氧菌組成的混合感染，具有豐富的菌群多樣性特征。未獲培養(yǎng)類別的細(xì)菌組成了根尖周初次感染和持續(xù)感染的主要微生物群落。根管初次感染與持續(xù)感染的菌群構(gòu)成和數(shù)量均有所區(qū)別。
　　 第二章根管治療后持續(xù)感染的微生物定植模式分析
　　 研究目的：
　　 采用組織形態(tài)學(xué)和電鏡觀察的方法了解根管治療失敗后持續(xù)感染根管微生物的組

6、織結(jié)構(gòu)和定植模式，為制定根尖周持續(xù)感染的有效治療策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料方法：
　　 收集16例根管治療失敗后的難治性根尖周炎病例，采用顯微根尖手術(shù)切除根尖標(biāo)本。6例根尖標(biāo)本通過(guò)組織學(xué)染色觀察根尖周組織的組織學(xué)狀態(tài)和微生物的形態(tài)及其在根尖的定植情況。5例根尖標(biāo)本縱向劈開(kāi)后在掃描電鏡下分別觀察牙本質(zhì)面和牙根表面的細(xì)菌生物膜形態(tài)和分布。5例根尖標(biāo)本在透射電鏡下觀察根管生物膜的形態(tài)和分布。
　　 結(jié)果：
　

7、　 (1)6例進(jìn)行組織學(xué)染色的根尖標(biāo)本中，有5例可觀察到菌斑附著于根管壁表面，并沿牙本質(zhì)小管侵入到牙本質(zhì)深層，浸入深度由100μm至500μm不等。6例標(biāo)本的根尖周組織均形成了根尖囊腫，有1例標(biāo)本根尖囊腫的囊腔內(nèi)有異物顆粒形成的結(jié)晶體，另有1例標(biāo)本在根尖囊壁中出現(xiàn)膽固醇晶體沉積，表現(xiàn)為狹長(zhǎng)的針形裂隙。
　　 (2)根管內(nèi)壁牙本質(zhì)面和根尖牙骨質(zhì)面在掃描電鏡下均可觀察到菌斑生物膜結(jié)構(gòu)，膠原纖維網(wǎng)形成支架結(jié)構(gòu)，密集的細(xì)菌群落鑲嵌于膠

8、原纖維網(wǎng)支架之中，被結(jié)構(gòu)致密的胞外多糖基質(zhì)覆蓋包裹，構(gòu)成生物膜。細(xì)菌組成以球菌和桿菌為主。
　　 (3)根尖標(biāo)本橫斷面切片在透射電鏡下可觀察到根管充填物與根管壁之間形成的不規(guī)則間隙區(qū)內(nèi)有大量球菌包繞呈團(tuán)塊狀，部分細(xì)菌分解崩裂導(dǎo)致胞壁不完整。
　　 結(jié)論：
　　 微生物在根管治療后持續(xù)感染的根管內(nèi)牙本質(zhì)面和牙根外牙骨質(zhì)面以菌斑生物膜的方式定植，并可侵入牙本質(zhì)小管達(dá)500μm，是造成根管治療失敗的重要原因。膽固醇晶體

9、和根管內(nèi)異物是導(dǎo)致根管治療失敗的非微生物因素。
　　 第三章光活化消毒控制根尖周感染根管內(nèi)細(xì)菌的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)
　　 研究目的：
　　 采用real-time PCR的定量方法評(píng)價(jià)光活化消毒技術(shù)處理初次感染和再次感染根管內(nèi)菌斑生物膜的抗菌作用，為進(jìn)一步提高根管治療成功率提供新的根管消毒方法。
　　 材料方法：
　　 收集15例慢性根尖周炎初次感染和8例根管治療后持續(xù)感染病例，去除壞死牙髓組織或根管充

10、填物后，分別進(jìn)行根管治療前、根管機(jī)械化學(xué)預(yù)備后以及光活化消毒處理后根管內(nèi)樣本的采集，提取細(xì)菌總DNA，采用real-time PCR定量檢測(cè)根管內(nèi)細(xì)菌的總量，比較各組之間細(xì)菌總量的差別。
　　 結(jié)果：
　　 治療前初次感染的根管內(nèi)細(xì)菌總數(shù)較持續(xù)感染的根管內(nèi)細(xì)菌總數(shù)多(P=0.001)。對(duì)于初次感染病例，根管內(nèi)細(xì)菌總數(shù)治療前為2.40×106，經(jīng)根管機(jī)械化學(xué)預(yù)備后降至1.78×104(降低99.26％)，光活化消毒后降至7

11、.41×103(降低99.69％)。對(duì)于持續(xù)感染病例，根管內(nèi)細(xì)菌總數(shù)治療前為2.95×105，經(jīng)根管機(jī)械化學(xué)預(yù)備后降至5.13×103(降低98.26％)，光活化消毒后降至1.66×103(降低99.44％)。經(jīng)雙因素方差分析比較，根管機(jī)械化學(xué)預(yù)備和光活化消毒后，細(xì)菌總量較治療前均有明顯減少(P=0.000)，光活化消毒可進(jìn)一步減少根管機(jī)械化學(xué)預(yù)備后根管內(nèi)的細(xì)菌總量，二者聯(lián)合應(yīng)用的滅菌效果優(yōu)于單純使用根管機(jī)械化學(xué)預(yù)備(P=0.048)。