不同劑量中波紫外線對HaCaT細胞p62及自噬體形成關鍵基因Beclin-1、Atg12和Atg3的調控效應研究.pdf

1、背景：中波紫外線主要作用于表皮，角質形成細胞是其重要的靶細胞，可以引起角質形成細胞內的蛋白損傷，而有效地清除損傷蛋白對于維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)定至關重要。p62是一種具有多種生物學功能的泛素結合蛋白，其C端的泛素相關（ubiquitin-associated，UBA）結合區(qū)可識別錯誤折疊蛋白的泛素部位，p62通過LC3相互作用區(qū)域(LC3-interacting region，LIR)與LC3結合，并在泛素化蛋白上共定位，形成的多聚泛素化蛋

2、白-p62復合物通過自噬途徑降解。因此p62是聯(lián)系泛素化蛋白和自噬途徑重要的中介物。自噬是廣泛存在于真核細胞的生理現(xiàn)象，其主要功能是降解變性蛋白質及受損細胞器。研究發(fā)現(xiàn)角質形成細胞也存在自噬現(xiàn)象，并可減輕角質形成細胞的炎癥。然而，UVB損傷是否可以誘導角質形成細胞的p62蛋白表達變化，以及損傷細胞中p62的表達差異是否與自噬體形成產(chǎn)生生物學關聯(lián)，這些問題的答案目前尚不得而知。在這個研究中，我們對此問題做出初步探索。通過我們的研究有助于初

3、步明確以紫外線損傷是否對角質形成細胞中p62為核心的蛋白降解途徑產(chǎn)生影響。
　　目的：探討不同劑量中波紫外線(UVB)照射培養(yǎng)的HaCaT細胞后不同時間點對p62、Beclin-1、Atg12和Atg3蛋白表達水平的調控效應。
　　方法：4.5、10和50mJ/cm2UVB照射HaCaT細胞后4h，使用透射電鏡檢測細胞超微結構變化。4.5、10和50mJ/cm2UVB照射HaCaT細胞，照射后加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4h和12

4、h，同時設相同處理但不照射UVB的細胞為對照細胞。另設觀察組，在照射后立即（包括對照細胞），使用含蛋白酶抑制劑E64D（10μg/L）和胃酶抑素(10μg/L)的培養(yǎng)基孵育4h和12 h，以阻斷對p62的降解。使用Western印跡法測定HaCaT細胞p62、Beclin-1、Atg12和Atg3蛋白的表達水平。
　　結果：4.5、10mJ/cm2UVB照射后，HaCaT細胞內出現(xiàn)自噬體結構，并且這種結構在4.5mJ/cm2照射后

5、更為多見，然而，50mJ/cm2UVB照射后，細胞中罕有此類結構。50 mJ/cm2UVB照射HaCaT細胞后4h，p62表達水平(p62與內參的比值為0.473±0.022)較對照細胞(0.246±0.038)升高(t=15.27，P＜0.05);阻斷溶酶體后，細胞新生p62水平(0.445±0.035)與阻斷溶酶體的對照(0.244±0.016)相比，仍為上調(t=7.62，P＜0.05)。在4.5 mJ/cm2UVB照射細胞后12

6、h，與對照(0.254±0.035)相比，HaCaT細胞p62表達上調(0.497±0.047，t=22.89，P＜0.05);阻斷溶酶體后，與阻斷溶酶體的對照(0.257±0.025)相比，p62表達水平仍然上調(0.548±0.051，t=17.42，P＜0.05)。4.5 mJ/cm2和50 mJ/cmUVB照射后4h和12h，對照細胞和照射細胞間的Bcclin-1、Atg12和Atg3的表達差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，阻