牽張成骨過程中被動牽拉延長神經(jīng)的變化機理研究.pdf

1、肢體延長（limb lengthening）是利用生物組織的“張力應力”法則，對離斷的肢體施加牽引力，使分開的骨段間隙被新骨取代的肢體矯形技術，也稱為牽張成骨（Distraction Osteogenesis，DO）技術。該技術目前已成為矯形外科、頜面外科畸形矯正和骨缺損治療的主要手段。關于DO過程中新生骨周圍同期受到牽拉的軟組織，特別是周圍神經(jīng)擴展延長的生物學反應和作用機制尚未進行深入研究和探討。然而，臨床肢體牽拉后神經(jīng)纖維的損傷所致

2、相關并發(fā)癥的持續(xù)存在和居高不下的發(fā)生機率，增加了該實驗研究的必要性和迫切性。成骨部位的周圍神經(jīng)必然會受到損傷，但是在DO的礦化期會自發(fā)得到修復，究其恢復機制如何，相關參考文獻極少。
　　 目的：明確牽張成骨過程中周圍神經(jīng)再生的作用機制。（1）建立脛骨延長動物模型；（2）通過斷層切片觀察了解DO礦化期不同時段新生骨及其周圍組織結(jié)構的形態(tài)學變化趨勢；（3）觀察分析牽拉延長后的周圍神經(jīng)組織超微結(jié)構；（4）觀察和探討神經(jīng)生長因子（NGF

3、）及其受體（p75NGFR）在肢體延長過程中被動延長神經(jīng)中的表達情況和作用機制，探討牽張成骨中周圍被動延長組織的適應過程，特別是被動延長周圍神經(jīng)的形態(tài)變遷，相關細胞因子在此適應過程的變化趨勢。（5）初步嘗試微波輻射在免疫熒光組織化學染色中的應用。
　　 方法：動物模型選用日本大耳白兔，于右后肢安裝單臂外固定支架并實施脛骨干上1/3截骨術，以制備肢體延長模型。術后7天開始延長，速率為1mm/d（0.5mm/d，2次/d），共計10

4、天完成延長脛骨1cm。動物模型在延長及礦化過程中應用X線攝像觀察延長區(qū)域骨痂生長情況；礦化期0，7，14，28，56天分設實驗組。制備火棉膠包埋薄型化橫斷連續(xù)切片，于典型層面觀察新生骨及其周圍組織結(jié)構的位置關系及進行主要參數(shù)的測量分析；取材牽拉延長的脛神經(jīng)，石蠟包埋切片進行HE染色，新鮮取材組織進行透射電鏡的超微組織結(jié)構觀察；石蠟切片免疫組化和雙重免疫熒光染色，檢測NGF及其受體p75NGFR在礦化期不同時相的表達情況。應用微波進輻射進

5、行抗原修復和免疫熒光檢測。
　　 結(jié)果：
　　 1.動物模型成功制備；隨礦化期延長，動物關節(jié)活動逐漸恢復改善；X線動態(tài)觀察骨痂影像逐漸清晰，骨痂量逐漸增加，兩端的骨皮質(zhì)匯合，逐漸出現(xiàn)骨髓腔，皮質(zhì)骨和髓腔分界清楚，最后骨痂堅強愈合，延長肢體力線佳，沒有出現(xiàn)畸形愈合；
　　 2.延長部位橫斷面的斷層切片觀察結(jié)果：以延長骨為中心觀察周圍各種組織的位置關系及變化，測量新生骨的實際生長面積以及新生骨與周圍神經(jīng)和血管的徑線并

6、進行比較分析，了解肢體延長過程中各組織的適應情況；
　　 3.牽拉延長神經(jīng)表現(xiàn)為牽拉外力導致的神經(jīng)損傷和修復過程。早期，光鏡下可見神經(jīng)纖維排列紊亂、郎飛氏結(jié)區(qū)增寬、髓鞘腫脹，可見神經(jīng)纖維擴展性脫髓鞘電鏡下神經(jīng)纖維髓鞘板層結(jié)構疏松，可見空泡狀髓鞘變性及環(huán)形小體，可見腫脹壓迫軸突；延長后7天，光鏡下神經(jīng)纖維出現(xiàn)輕度修復性變化，電鏡下可見新生髓鞘；隨礦化期時間的延長，神經(jīng)損傷逐漸自我修復，至礦化56天神經(jīng)纖維結(jié)構基本恢復正常，但仍可觀

7、察到新生髓鞘。
　　 4.NGF和p75NGFR在脛骨延長后不同礦化時期表達不同，基本表達規(guī)律為礦化早期（D7和D14組）位于軸索外層的雪旺氏細胞表達呈現(xiàn)強陽性，達到高峰，而DO組和D28組呈弱陽性或陰性表達，至D56組幾乎檢測不到。
　　 5.微波輻射應用于免疫熒光檢測可以大量節(jié)約實驗時間，染色效果較佳。
　　 結(jié)論：
　　 1.家兔是肢體延長模型制作中的優(yōu)選動物，建立的改良家兔肢體延長模型可以符合后續(xù)

8、實驗要求，獲得可靠實驗數(shù)據(jù)。應用X線可對延長不同時期的新骨形成情況進行監(jiān)測，。
　　 2.礦化期不同時相中火棉膠薄型化橫斷面切片可以清晰觀察新骨及周圍各相關組織結(jié)構的形態(tài)學位置關系和變化過程，為臨床提供翔實的形態(tài)學資料；
　　 3.緩慢肢體延長過程中周圍神經(jīng)的亞臨床損害是可逆的，在神經(jīng)損傷的同時自然修復已經(jīng)開始。
　　 4.p75NGFR在肢體延長過程中受損神經(jīng)的雪旺氏細胞中的豐富表達，證明其對于神經(jīng)的髓鞘再生和