貢嘎蝠蛾幼蟲腸道微生物區(qū)系的研究.pdf

1、貢嘎蝠蛾(Hepialus gonggaensis)幼蟲是名貴中藥材冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)的優(yōu)勢寄主之一。在冬蟲夏草人工培植中蝠蛾幼蟲的飼養(yǎng)是基礎(chǔ)。但目前人工養(yǎng)殖蝠蛾幼蟲中幼蟲抗逆力弱，易受微生物感染，是影響冬蟲夏草資源保護(hù)和開發(fā)的重要制約因子。研究貢嘎蝠蛾幼蟲腸道菌群多樣性，對于研究其營養(yǎng)生理，進(jìn)而改善和研制蝠蛾人工飼料，提高幼蟲抗逆力和成活率有重要意義。
　　本研究以四川康定雅家埂山上采集的貢嘎蝠蛾為

2、實驗材料，利用傳統(tǒng)分離純化技術(shù)與分子生物學(xué)方法研究了貢嘎蝠蛾幼蟲腸道微生物多樣性。用傳統(tǒng)的分離純化，以及生理生化鑒定的結(jié)果顯示，貢嘎蝠蛾幼蟲腸道中共分離出12種不同的細(xì)菌,經(jīng)鑒定分屬于8個屬。貢嘎蝠蛾幼蟲腸道中還存在3種不同的真菌，分別是隱球酵母（Cryptococcus magnus）、Geomyces sp和絲孢酵母（Trichosporon porosum）3個類群的真菌。
　　首先，采用基于16S rRNA基因的RFLP（

3、Restriction Fragment Length Polymorphism）法，通過保守序列設(shè)計引物對貢嘎蝠蛾幼蟲腸道細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對擴(kuò)增得到的16S rRNA序列連接到PMD18-T載體中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中，建立16S rRNA克隆文庫。用限制性內(nèi)切酶EocRI、MspI和HaeⅢ對16S rRNA克隆文庫中的204個陽性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行酶切分析，結(jié)果顯示有有35個不同的RFLP操作分類單元（

4、OTU）。其次，采用基于ITS（internal transcribed spacer）基因的RFLP方法，以貢嘎蝠蛾幼蟲腸道真菌的總DNA為模板，用真菌ITS區(qū)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。建立貢嘎蝠蛾幼蟲腸道真菌的ITS克隆文庫，分別用MspI、HaeⅢ和TaqI對205個陽性克隆的質(zhì)粒酶切指紋圖譜分析，結(jié)果顯示有23個不同的RFLP操作分類單元。因為每種圖譜很可能就代表一個不同的微生物種群，所以通過分析 RFLP圖譜，即可相應(yīng)反映出該環(huán)

5、境中微生物種類的數(shù)量及群落中的優(yōu)勢菌群。
　　把RFLP分析得到的35種有差異的16S rRNA酶切圖譜以及23種有差異的ITS酶切圖譜的克隆進(jìn)行測序。并對所得序列以分子信息技術(shù)進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果表明：共有11個不同屬的細(xì)菌存在于貢嘎蝠蛾幼蟲腸道中，其中有15個操作單元都代表Rahnella sp，9個操作單元都代表Carnobacterium sp，這兩種菌屬分別占總16S rRNA克隆文庫的45.58％和30.88%；共

6、有8個不同屬的真菌存在于貢嘎蝠蛾幼蟲腸道中，其中被孢霉屬（Mortierella）和絲孢酵母屬（Trichosporon）的豐度最高，分別占克隆文庫的46.34%和40.00%，鑒定為腸道內(nèi)的優(yōu)勢真菌類群。
　　結(jié)果顯示，貢嘎蝠蛾幼蟲腸道中存在著大量的細(xì)菌和真菌，它們的種類和數(shù)量各不相同，即貢嘎蝠蛾幼蟲腸道中具有豐富的微生物多樣性。此方法對貢嘎蝠蛾幼蟲腸道微生物進(jìn)行研究將是可行的。在RFLP法與純培養(yǎng)的比較研究中，兩種方法檢測到的