何首烏促黑素生成的有效成分及其作用機制研究.pdf

1、黑色素代謝障礙是白發(fā)生成和色素性皮膚病的共同致病機理。何首烏自唐代-就被用于治療白發(fā)，迄今已有千余年歷史。近年來，何首烏又被用于白癜風等色素性皮膚病的輔助治療。但有關(guān)何首烏中具有烏發(fā)或治療色素性疾病作用的活性成分及其藥理作用機制的研究，目前還是空白。 本文選用何首烏對黑色素生成的促進作用為指標，以蘑菇酪氨酸酶為模型，對何首烏藥材的提取物及6種主要成分進行活性篩選,確定了其活性成分；采用高速逆流色譜法(High-speed Cou

2、ntercurrent Chromatography，簡稱HSCCC)進行有效成分分離；通過離體和在體實驗相結(jié)合的方法對何首烏促黑素生成的合理性進行了科學的評價，佐證了其傳統(tǒng)功效的科學含義，對何首烏的現(xiàn)代研究及應(yīng)用均具有重要指導(dǎo)意義。本文主要包含以下幾個方面的研究： 1．采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法對何首烏藥材提取物及6種主要成分進行了活性篩選。篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)：何首烏生藥和炮制品乙醇提取物均有激活蘑菇酪氨酸酶的活性。何首烏炮制品

3、醇提物的激活率高于同濃度生藥醇提物的激活率，二者均在75μg/ml的濃度下激活率最高。何首烏的6種化學成分中2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷(2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，簡稱二苯乙烯苷或THSG)對蘑菇酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)有顯著的激活作用，在終濃度為0.12～75 μg/ml范圍內(nèi)，激活率在11.7～126.2﹪范圍內(nèi)逐漸增

4、高；沒食子酸對酪氨酸酶有顯著抑制作用，在終濃度為0.12～75μg/ml范圍內(nèi)，抑制率在4.2～30﹪范圍內(nèi)逐漸增大。其中，在75 μg/ml濃度下的抑制率為30﹪；4種葸醌類化合物對蘑菇酪氨酸酶無明顯影響，蒽醌化合物的激活率范圍分別為：大黃素(15～33﹪)、大黃酚(11～16﹪)、大黃素甲醚(7～13﹪)、蘆薈大黃素(3～9﹪)。二苯乙烯苷激活蘑菇酪氨酸酶的半數(shù)有效劑量EC<,50>為7.2μM。 2．采用高速逆流色譜法，用

5、改良的溶劑系統(tǒng)對活性成分二苯乙烯苷進行分離純化。研究了溶劑的系統(tǒng)適用性，確定實驗的分離條件：正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(1：50：1：50)(V/V)。利用HSCCC法分離得到的二苯乙烯苷樣品純度高于93﹪。采用HSCCC的方法從何首烏中共分離得到THSG樣品85.6：mg。 3．首次對二苯乙烯苷促黑素生成的藥理活性進行了研究。藥理研究內(nèi)容包括以下三個方面： 1)二苯乙烯苷對B16黑色素瘤細胞黑素生成和酪氨酸酶活性的影響

6、。實驗結(jié)果顯示，二苯乙烯苷有促進黑色素瘤細胞合成黑素作用。THSG與光敏劑8-甲氧補骨脂素(8-Methoxypsoralen，8-MOP)相比無顯著性差異(P>0．05)。 2)棕黃色豚鼠皮膚增色實驗。在整體動物水平上對二苯乙烯苷促黑素生成的藥理作用進行了研究。實驗結(jié)果顯示，二苯乙烯苷能使豚鼠背部皮膚含黑素顆粒的細胞數(shù)增加，’THSG中、高劑量組與陰性對照組比較有顯著性差異(P<0.01或0.05)，與0.1﹪8-甲氧補骨脂素

7、無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。二苯乙烯苷能使豚鼠皮膚黑素含量指數(shù)(melanin content index，MCI)增高。二苯乙烯苷中劑量組和高劑量組的黑素含量指數(shù)MCI-1與對照組相比有顯著增加(P<0.05)。二苯乙烯苷高、中、低三個劑量組不同區(qū)域的黑素含量指數(shù)MCI-2與對照組相比均有顯著性增加(P<0.01或0.05)，說明二苯乙烯苷能促進豚鼠背部皮膚黑素生成。 3)二苯乙烯苷激活蘑菇酪氨酸酶一多巴氧化系統(tǒng)的反應(yīng)機制。

8、實驗發(fā)現(xiàn)：THSG對酪氨酸酶的激活屬于競爭性激活；THSG能提高底物左旋多巴(L-DOPA)與TYR的親和能力，在有0.25 mM THSG存在的溶液中底物L-DOPA與TYR提高為原來的1.88倍；在溶液混和的過程中L-DOPA的結(jié)構(gòu)或構(gòu)象發(fā)生了較大改變；THSG通過改變：L-DOPA構(gòu)象，使L-DOPA與TYR碰撞的有效分子數(shù)增加，從而加速了反應(yīng)。 隨著中藥現(xiàn)代化理論的提出和發(fā)展，用現(xiàn)代藥理學解釋傳統(tǒng)中藥的功能主治已成為中藥