細(xì)梗胡枝子治療腎小球腎炎的有效成分及其作用機(jī)制研究.pdf

1、慢性腎小球腎炎是臨床上的常見病，多發(fā)病，疑難病，慢性腎小球腎炎患者病情遷延，可以臨床緩解，但很難完全康復(fù)，最后發(fā)展為終末期腎衰導(dǎo)致死亡。因此，探討慢性腎小球腎炎的發(fā)病機(jī)制，掌握病情進(jìn)展的環(huán)節(jié)，尋求最佳的治療方案和有效藥物，治療早期腎臟疾病并發(fā)癥，從而延緩疾病的進(jìn)展，為最終改善腎臟病患者治療質(zhì)量和預(yù)后奠定基礎(chǔ)。 Harris等在動(dòng)物腎臟缺血再灌注實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，健存腎單位代償性功能亢進(jìn)，耗氧量明顯增加，由此提出了高代謝學(xué)說，這使得研究

2、人員對(duì)腎炎發(fā)病機(jī)制有了突破性的進(jìn)展：許多與腎小球腎炎發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的因素和環(huán)節(jié)，如多種細(xì)胞因子、血管活性物質(zhì)和化學(xué)趨化因子表達(dá)過多、細(xì)胞外基質(zhì)積聚、腎小球系膜細(xì)胞異常增殖或腎小管上皮細(xì)胞肥大等都涉及到一種重要的機(jī)制--氧化應(yīng)激。 豆科植物細(xì)梗胡枝子(Lespedezavirgata(Thurb)DC)是臨床上用于治療慢性腎小球腎炎的中成藥腎炎四味片中的君藥，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)細(xì)梗胡枝子進(jìn)行化學(xué)成分分析發(fā)現(xiàn)，其中富含大量的黃酮及酚酸類

3、化合物，而黃酮類與酚酸類化合物因其強(qiáng)大的抗氧化能力而普遍受到關(guān)注。我們前期的實(shí)驗(yàn)研究表明，細(xì)梗胡枝子的總黃酮部位對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的大鼠微小病變性腎病綜合征有一定的治療作用，但是，細(xì)梗胡枝子中究竟是哪些成分在發(fā)揮有效作用，且其藥效機(jī)制是否與抑制氧化應(yīng)激有關(guān)，迄今為止國內(nèi)外尚無研究報(bào)告。闡明這些，不僅能從該植物中尋找到治療腎小球腎炎的有效成分，還能從抗氧化的角度進(jìn)一步明確細(xì)梗胡枝子對(duì)腎臟的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。 腎小球系膜細(xì)胞，是腎小球

4、固有的三大細(xì)胞之一，具有活躍的生理功能，在腎小球炎癥及硬化的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。實(shí)驗(yàn)表明，氧自由基作為信號(hào)分子，通過激活蛋白激酶C(PKC)，調(diào)控細(xì)胞增殖水平而導(dǎo)致腎小球硬化。 腎小球疾病中，腎小管間質(zhì)纖維化的嚴(yán)重性不容忽視。大量無法及時(shí)清除的氧自由基可刺激腎小管上皮細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，其主要組成成分如纖維連接蛋白(FN)，層粘連蛋白(LN)，膠質(zhì)等可直接導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化，也可活化核轉(zhuǎn)錄因子KappB(NF

5、-KB)，刺激纖維化生長因子，如轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)，單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)的過表達(dá)，放大腎臟局部免疫反應(yīng)，進(jìn)一步損傷腎小管間質(zhì)。 本課題采用藥理學(xué)追蹤指導(dǎo)化學(xué)活性分離的方法，應(yīng)用現(xiàn)代層析技術(shù)及波譜方法從細(xì)梗胡枝子中分離活性成分并鑒定化學(xué)結(jié)構(gòu)：同時(shí)，運(yùn)用快速測(cè)定抗氧化能力指數(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)、MTT、免疫組織化學(xué)、Westernblotting、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)手段，從體外的角度觀察細(xì)梗胡枝子總黃酮對(duì)炎癥介質(zhì)脂多糖(

6、LPS)刺激大鼠腎小球系膜細(xì)胞異常增殖的抑制作用；分析了細(xì)梗胡枝子活性成分對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的人類腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的影響，并初步探討了這種作用所涉及的可能機(jī)制，以期明確其對(duì)病理狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用，闡明了其作為一種抗氧化劑防治腎小球腎炎的重要意義，為臨床治療腎小球腎病以及其它腎臟疾病的防治提供了新的理論線索和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分：胡枝子屬植物資源調(diào)查 目的：概述胡枝子屬植物的種屬分類，形態(tài)特征及地

7、理分布，了解胡枝子化學(xué)成分的研究進(jìn)展及其藥理活性。 方法：采用本草考證和文獻(xiàn)調(diào)研的方法對(duì)胡枝子屬植物的研究進(jìn)展做一綜述。 結(jié)果：我國產(chǎn)胡枝子屬植物26種，分布廣泛；迄今為止共從該屬植物中分離得到黃酮、生物堿、有機(jī)酸等化學(xué)成分，具有極高的藥用價(jià)值。 結(jié)論：胡枝子屬植物資源豐富，價(jià)廉易得，藥理活性明確，具有很好的開發(fā)利用價(jià)值。 第二部分：胡枝子總黃酮抑制大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的作用研究 目的：觀察胡枝

8、子總黃酮誘導(dǎo)異常增殖的大鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡并探討可能介導(dǎo)凋亡的途徑。 方法：四甲基偶氮唑(MTT)比色法測(cè)定胡枝子總黃酮對(duì)系膜細(xì)胞增殖的抑制作用；Heochst33342/PI雙染色后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；AnnexinV/PI雙染色流式細(xì)胞儀(FCM)定量分析系膜細(xì)胞的凋亡；試劑盒測(cè)定細(xì)胞上清MDA含量、SOD及GSH-PX活性；casepase活性檢測(cè)試劑盒定量分析細(xì)胞內(nèi)半胱天冬氨酸酶3(casepase-3)的表達(dá)。

9、 結(jié)果：MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)證明胡枝子總黃酮可顯著抑制大鼠系膜細(xì)胞的增殖(P<0.05)。Hochest33342/PI雙染條件下，熒光顯微鏡可明顯區(qū)分胡枝子總黃酮作用細(xì)胞24小時(shí)后的早期凋亡細(xì)胞和中晚期凋亡細(xì)胞。FCM定量分析發(fā)現(xiàn)系膜細(xì)胞凋亡數(shù)量與胡枝子總黃酮濃度呈劑量依賴性(P<0.05)。與對(duì)照組比較，1000、200及40μg/ml胡枝子總黃酮組的SOD和GSH-PX活性顯著增高(P<0.05)，而MDA含量則顯著降低(P<0

10、.05)。Casepase活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胡枝子總黃酮可增加細(xì)胞內(nèi)casepase-3的表達(dá)，并且呈濃度依賴性增加。 結(jié)論:胡枝子總黃酮誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞凋亡，抑制其增殖可能與抗氧化效應(yīng)相關(guān)。 第三部分:細(xì)梗胡枝子化學(xué)活性成分的研究 目的:研究豆科植物細(xì)梗胡枝子(Lespedezavirgata)的化學(xué)成分。 方法:將乙醇提取物的正丁醇部分進(jìn)行反復(fù)柱色譜，利用光譜方法對(duì)分離得到的單體進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。 結(jié)

11、果:分離并鑒定了19個(gè)化合物，分別為β-谷甾醇(A1)，硬脂酸(A2)，7-O-α-吡喃鼠李糖基山萘酚苷(A3)，7-O-α-L吡喃鼠李糖基-山萘酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(A4)，槲皮素(A5)，對(duì)羥基反式肉桂酸(A6)，原兒茶酸(A7)，對(duì)羥基苯甲酸(A8)，苜蓿素(A9)，山奈酚(A10)，胡枝子酚(A11)，芹菜素(A12)，胡枝子醛(A13)，山奈酚苷(A14)，桑色素(A15)，木犀草素(A16)，槲皮素-3-O-α-

12、L鼠李糖苷(A17)，胡枝子內(nèi)酯(A18)，柯伊利素H-7-O-β-D-蘆丁糖苷(A19)。 結(jié)論:化合物A11、A13、A18為三個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的新化合物，A19為首次從胡枝子屬植物中分離獲得，化合物A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A12、A15、A16為首次從該植物中分離獲得。 第四部分:細(xì)梗胡枝子中三個(gè)新化合物的抗氧化活性研究 目的:研究細(xì)梗胡枝子正丁醇部位三個(gè)新化合物體外抗氧化能

13、力 方法:以維生素C(VitaminC)為陽性對(duì)照，采用抗氧化能力指數(shù)(ORAC)方法測(cè)定胡枝子酚、胡枝子醛及胡枝子內(nèi)酯體外抗氧化活性；復(fù)制溴酸鉀(0.7mmol/kg)誘導(dǎo)大鼠腎損傷模型，TBARS法測(cè)定三個(gè)新化合物體外清除大鼠腎勻漿及血漿中過氧化脂質(zhì)的能力。 結(jié)果:三個(gè)新化合物抗氧化能力均較VitaminC強(qiáng)；TBARS方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，三個(gè)新化合物抑制大鼠腎勻漿及血漿中MDA的半數(shù)抑制率(IC50)由強(qiáng)至弱順序?yàn)椋汉?/p>

14、子酚>胡枝子內(nèi)酯>胡枝子醛。 結(jié)論:三個(gè)新化合物均有很強(qiáng)清除氧自由基的能力。 第五部分:胡枝子酚對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的抑制作用 目的:觀察胡枝子酚(Lespedezavirgatol)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的影響并探討其可能的作用機(jī)制。 方法:采用雙氫一乙酞乙酸二氯熒光黃(DCFH-DA)捕獲細(xì)胞內(nèi)ROS，應(yīng)用流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)生成ROS的情況

15、。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)纖維連接蛋白(FN)的表達(dá)；Westernblotting方法觀察TGF-β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞MMP-9和NF-KB的蛋白表達(dá)。 結(jié)果:Lespedezavirgatol可抑制TGF-β1作用下ROS水平的升高，模型組FN強(qiáng)陽性表達(dá)，苯那普利組FN中等量表達(dá)，Lespedezavirgatol低、中、高劑量組FN輕度表達(dá)，明顯少于模型組，并呈劑量依賴關(guān)系。藥物干預(yù)24小時(shí)后，MMP-9的表達(dá)明顯

16、上調(diào)，NF-KB的表達(dá)較正常水平低(P<0.05)。 結(jié)論:Lespedezavirgatol能顯著抑制TFGF-β1作用下腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高。其抑制細(xì)胞內(nèi)FN的表達(dá)并下調(diào)NF-KB，上調(diào)MMP-9的蛋白表達(dá)，這可能是Lespedezavirgatol減緩腎小球硬化和腎纖維化發(fā)展的機(jī)制之一。 總結(jié): (1)細(xì)梗胡枝子中富含大量抗氧化活性成分； (2)Lespedezavirgatol具有強(qiáng)大