漢灘病毒多組分新型重組腺病毒的制備及免疫學(xué)特性研究.pdf

1、【背景】
　　漢坦病毒感染可引起兩類不同的嚴(yán)重感染性疾病,即腎綜合征出血熱(Hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)和漢坦病毒肺綜合征(Hantavirus pulmonary syndrome,HPS)。其中HFRS多見于亞洲及東北歐部分地區(qū),主要由漢灘病毒(Hantaan virus,HTNV)、首爾病毒(Seoul virus,SEOV)和普馬拉病毒(Puumala virus,

2、PUUV)等引起。我國是世界上HFRS疫情最嚴(yán)重的國家,流行范圍廣,發(fā)病人數(shù)多,病死率較高。HFRS是我國危害最嚴(yán)重的急性傳染病之一。目前我國已研制成功 HFRS滅活疫苗,其推廣使用對預(yù)防 HFRS的發(fā)生和流行起到了積極作用。但該類疫苗仍存在一些問題,主要是不能有效刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的能力也較弱,抗體滴度不高;此外,目前對于滅活疫苗在制備與使用中的安全性尚存在一些爭議。因此,研發(fā)新型的HFRS疫苗將有助于進(jìn)一步提高我

3、國對HFRS的防控水平。
　　漢坦病毒基因組包括L、M、S等3個片段,分別編碼病毒的RNA聚合酶、包膜糖蛋白(glycoprotein,GP)Gn、Gc以及核衣殼蛋白(nucleoprotein,NP)。GP和NP都是誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答的主要結(jié)構(gòu)蛋白,其中的Gn及Gc可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,在機(jī)體的保護(hù)性體液免疫應(yīng)答中起主要作用,但其免疫原性較弱,特別是刺激機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力較弱;NP的免疫原性很強(qiáng),特別是在NP上存在多個CTL

4、表位,在誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答中起主要作用,可有效保護(hù)漢坦病毒對實(shí)驗(yàn)動物的攻擊。因此,同時應(yīng)用漢坦病毒GP與NP作為重組疫苗的組分有可能達(dá)到優(yōu)勢互補(bǔ),提高免疫應(yīng)答效果的目的。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了含HTNV S基因0.7kb片段與M基因嵌合基因的一系列原核與真核表達(dá)載體,并進(jìn)行了融合表達(dá)以及基因免疫。結(jié)果表明,嵌合基因表達(dá)的融合蛋白能有效刺激機(jī)體的體液免疫應(yīng)答以及部分細(xì)胞免疫應(yīng)答;在不同的表達(dá)系統(tǒng)中,以重組腺病毒免疫的效果為好,但

5、仍存在融合蛋白的表達(dá)量偏低以及誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答水平尚不理想的問題。針對這些問題,本實(shí)驗(yàn)室正試圖通過對表達(dá)載體進(jìn)行改建,改善目的基因的構(gòu)成,采用不同的表達(dá)方式,聯(lián)合使用不同的分子佐劑等多種策略,來提高目的抗原的表達(dá)量及其誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答的能力,本研究的目的亦在于此。
　　【方法】
　　本研究在采用CAG啟動子及HSP70C分子佐劑的基礎(chǔ)上,采取兩條不同的技術(shù)路線,構(gòu)建多株含HTNV不同結(jié)構(gòu)蛋白及其CTL表位、不同組合方式、不同

6、表達(dá)方式的重組腺病毒,并對構(gòu)建的重組腺病毒誘導(dǎo)小鼠體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答的情況進(jìn)行觀察和比較。
　　(1)考慮到HTNV GP的表位為空間構(gòu)像依賴,將GP與NP融合表達(dá)可能會影響其空間構(gòu)型,從而影響到免疫原性,本研究使用腦心肌炎病毒內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(ECMV IRES)將GP、NP在同一腺病毒中分別表達(dá),更有利于保持其免疫學(xué)活性。
　　(2)加入有效的HTNV CTL表位基因(NP127~141aa、NP331~345a

7、a及NP421~429aa,以加間隔序列AAY的方式串聯(lián)),以提高融合蛋白刺激機(jī)體免疫應(yīng)答的能力,特別是提高細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。
　　【結(jié)果】
　　第一部分
　　含HTNV結(jié)構(gòu)基因雙順反子及HSP70C的重組腺病毒的制備及免疫學(xué)特性研究
　　1.構(gòu)建了可分別表達(dá) HTNV GP、NP及 HSP70C的重組腺病毒載體,轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞后,獲得了8株重組腺病毒,分別命名為 rAd-GnH-IRES-S0.7H、

8、rAd-GcH-IRES-S0.7H、rAd-GnH-IRES-S0.7、rAd-GcH-IRES-S0.7、rAd-Gn-IRES-S0.7H、rAd-Gc-IRES-S0.7H、rAd-Gn-IRES-S0.7、rAd-Gc-IRES-S0.7。重組腺病毒經(jīng)純化并測定滴度后,以100 pfu/cell的病毒量感染HEK293A細(xì)胞,免疫熒光檢測結(jié)果顯示,所有重組腺病毒均可表達(dá)目的蛋白。
　　2.將上述各重組腺病毒通過腹腔途徑免

9、疫C57BL/6小鼠,以腺病毒空載體、PBS及HFRS滅活疫苗為對照。通過ELISA及微量細(xì)胞培養(yǎng)中和試驗(yàn)對各組小鼠體液免疫應(yīng)答的情況進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示,各重組腺病毒均可刺激小鼠產(chǎn)生針對 HTNV GP、NP的特異性抗體及中和抗體,且添加HSP70C的各重組腺病毒免疫組抗體的幾何平均滴度(GMT)均高于對應(yīng)的未添加組;在含 Gn的各重組腺病毒組中, rAd-GnH-IRES-S0.7H免疫組小鼠血清的抗GP、NP抗體及中和抗體的GMT

10、均為最高,分別為95.1、320.0和30.3;在含Gc的各重組腺病毒組中,rAd-GcH-IRES-S0.7H免疫組小鼠血清的抗GP、NP抗體及中和抗體的GMT均為最高,分別為80.0、380.5和40.0;該兩種重組腺病毒誘導(dǎo)的中和抗體均高于滅活疫苗組(p<0.05)。
　　3.對上述各重組腺病毒免疫小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答情況進(jìn)行了檢測。CTL殺傷實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,融合 HSP70C的兩種重組腺病毒（rAd-GnH-IRES-S0.

11、7H和rAd-GcH-IRES-S0.7H)免疫組小鼠的脾細(xì)胞在各效靶比下殺傷效應(yīng)均為最好,且均高于滅活疫苗組（p<0.05)。ELISPOT檢測的結(jié)果表明,在各肽池刺激下rAd-GnH-IRES-S0.7H及rAd-GcH-IRES-S0.7H免疫組小鼠脾細(xì)胞的IFN-g分泌水平均為最高,且均高于滅活疫苗組(p<0.05)。表明融合HSP70C的重組腺病毒能更好的誘導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在使用重疊肽段作為刺激物進(jìn)行的ELISPOT實(shí)驗(yàn)

12、中,NP3肽池顯示出了最好的刺激效果,表明HTNV的NP在誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答中的作用比GP更為重要。
　　4.用HTNV76-118株攻擊各重組腺病毒免疫的小鼠,采用ELISA及RT-PCR對感染小鼠的部分臟器進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,各重組腺病毒免疫組小鼠臟器中的病毒抗原及病毒核酸量均低于 PBS對照組及空載免疫組,其中 rAd-GnH-IRES-S0.7H免疫組及rAd-GcH-IRES-S0.7H免疫組小鼠的HTNV抗原及核酸含

13、量均為最低,且與滅活疫苗組無顯著差別(p>0.05),表明其保護(hù)效果與滅活疫苗組相當(dāng)。
　　第二部分
　　含HTNV嵌合基因、CTL串聯(lián)表位及HSP70C的重組腺病毒的制備及免疫學(xué)特性研究
　　1.構(gòu)建了含HTNV S基因0.7kb片段與M基因的嵌合基因、CTL串聯(lián)表位及HSP70C的重組腺病毒載體,轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞后,獲得了4株重組腺病毒,分別命名為rAd-GnS0.7-CTLH、rAd-GnS0.7-CTL、

14、rAd-GcS0.7-CTLH、rAd-GcS0.7-CTL。重組腺病毒經(jīng)純化并測定滴度后,以100 pfu/cell的病毒量感染HEK293A細(xì)胞,免疫熒光檢測結(jié)果顯示,所有重組腺病毒均可表達(dá)目的蛋白。
　　2.將上述各重組腺病毒通過腹腔途徑免疫C57BL/6小鼠,以腺病毒空載體、PBS及 HFRS滅活疫苗為對照。通過 ELISA、微量細(xì)胞培養(yǎng)中和試驗(yàn)對各組小鼠體液免疫應(yīng)答的情況進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示,各重組腺病毒均可刺激小鼠產(chǎn)生

15、針對 HTNV GP、NP的特異性抗體及中和抗體,且添加HSP70C的兩個重組腺病毒免疫組抗體的GMT均高于對應(yīng)的未添加組;其中rAd-GnS0.7-CTLH免疫組小鼠血清的抗GP、NP抗體及中和抗體的GMT分別為80.0、320.0和26.4,均高于rAd-GnS0.7-CTL免疫組;rAd-GcS0.7-CTLH免疫組小鼠血清的抗 GP、NP抗體及中和抗體的GMT分別為113.1、452.5和30.3,該兩種重組腺病毒誘導(dǎo)的中和抗體

16、均高于滅活疫苗組(p<0.05)。
　　3.對上述各重組腺病毒免疫小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答情況進(jìn)行了檢測。CTL殺傷實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明, rAd-GnS0.7-CTLH免疫組在各效靶比下,殺傷效應(yīng)均強(qiáng)于rAd-GnS0.7-CTL組,且在效靶比為100:1時也強(qiáng)于滅活疫苗組(p<0.05);rAd-GcS0.7-CTLH免疫組在各效靶比下,殺傷效應(yīng)均強(qiáng)于rAd-GcS0.7-CTL組,且在效靶比為10:1及100:1時也強(qiáng)于滅活疫苗組(p<

17、0.05)。ELISPOT檢測的結(jié)果表明,在各肽池刺激下rAd-GnS0.7-CTLH及rAd-GcS0.7-CTLH免疫組小鼠脾細(xì)胞的IFN-g分泌水平均為最高(p<0.05);rAd-GcS0.7-CTLH免疫組 IFN-g分泌水平高于滅活疫苗組(p<0.05),在除Gn2肽池外的各肽池刺激下rAd-GnS0.7-CTLH組IFN-γ的分泌水平也高于滅活疫苗組(p<0.05)。同樣表明融合HSP70C的重組腺病毒能更好的誘導(dǎo)機(jī)體的細(xì)

18、胞免疫應(yīng)答。以本研究所采用的CTL表位序列的三個單獨(dú)的15 aa的肽段分別作為刺激物進(jìn)行ELISOPT實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示NP48及NP60肽段的刺激效果最好,表明其包含的CTL表位在誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答中的作用更為突出。
　　4.用HTNV76-118株攻擊各重組腺病毒免疫后的小鼠,采用ELISA及RT-PCR對感染小鼠的部分臟器進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,各重組腺病毒免疫組小鼠臟器中的病毒抗原及病毒核酸量均低于PBS對照及空載免疫組,其中rAd

19、-GnS0.7-CTLH免疫組及rAd-GcS0.7-CTLH免疫組小鼠的HTNV抗原及核酸含量均為最低,且與滅活疫苗組無顯著差別(p>0.05),表明其保護(hù)效果與滅活疫苗組相當(dāng)。
　　【結(jié)論】
　　本研究在采用CAG啟動子及HSP70C分子佐劑的基礎(chǔ)上,采取兩條不同的技術(shù)路線進(jìn)一步優(yōu)化了HTNV結(jié)構(gòu)蛋白在重組腺病毒中的表達(dá),并藉此提高其誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答的效果。一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,采用將HTNV GP和NP分別與HS

20、P70C融合,并用IRES將兩種融合蛋白分別表達(dá)的策略構(gòu)建的重組腺病毒,其誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力均得到了提升;采用同時添加CTL串聯(lián)表位及HSP70C的策略構(gòu)建重組腺病毒,也可有效提升其誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答及細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。上述兩種策略構(gòu)建的重組腺病毒誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答在多數(shù)指標(biāo)上均優(yōu)于滅活疫苗或與之相同;相比較而言,前一種策略構(gòu)建的重組腺病毒在誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答方面更具優(yōu)勢,而后一種策略在誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答方面更具優(yōu)勢。未來我們