HCV重組腺病毒的構(gòu)建、鑒定及初步免疫學(xué)效果觀察.pdf

1、目的:丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，簡(jiǎn)稱HCV）感染是當(dāng)前危害人類健康的重要傳染病之一，目前除干擾素聯(lián)合利巴韋林外尚無(wú)有效預(yù)防和治療手段。因此，尋找其他治療途徑，預(yù)防和清除HCV的持續(xù)感染很有必要。而將編碼HCV抗原的外源基因?qū)霗C(jī)體誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)的HCV新型疫苗目前正在受到人們的重視。以重組復(fù)制缺陷型腺病毒(replication-deficient recombinant adenovirus，rA

2、d)為載體的疫苗，能模擬天然病毒有效地將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞內(nèi)并使之高效表達(dá)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)目的抗原的免疫應(yīng)答。為此，我們利用AdMaxTM腺病毒包裝系統(tǒng)構(gòu)建可表達(dá)HCV核心抗原Core的HCV重組腺病毒 pAd-Core，并觀察其免疫小鼠后，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的能力，為進(jìn)一步研究防止HCV感染的基因疫苗和基因治療奠定基礎(chǔ)。 方法：RT-PCR法從丙型肝炎患者血清中擴(kuò)增出HCV Core基因,定向克隆到重組腺病毒AdM

3、axTM系統(tǒng)的穿梭質(zhì)粒pDC315的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pDC315-Core，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下與腺病毒基因組骨架質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，通過同源重組包裝產(chǎn)生復(fù)制缺陷型重組腺病毒 pAd-Core；經(jīng)HEK293細(xì)胞擴(kuò)增后，離子交換柱層析法純化病毒，測(cè)定病毒顆粒數(shù)和滴度；利用重組腺病毒體外感染人肝癌細(xì)胞株HepG2，經(jīng)免疫印跡（Western Blot）方法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)，通過

4、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme 1inked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)免疫小鼠血清抗體水平，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（enzyme-linked immunosorbent spot ,ELISPOT）檢測(cè)免疫小鼠特異性T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)。 結(jié)果:重組腺病毒 pAd-Core經(jīng)PCR及序列測(cè)定證實(shí)Core基因插入正確，在HEK293細(xì)胞中具有良好的感染性；擴(kuò)增純化后，重組腺病毒的比活性可達(dá)3.42IU/1