殼聚糖增強重組腺病毒轉導效率及口服免疫效果初步研究.pdf

1、5型重組腺病毒載體(rAdv)因具有基因轉導效率高、病毒載體滴度高及能感染非復制相細胞等多種優(yōu)點而得到廣泛應用，目前我國已經有兩種基于腺病毒的抗腫瘤藥物得到批準。但由于rAdv的基因轉導主要是通過柯薩奇病毒．腺病毒受體(CAR)介導，導致rAdv對CAR受體表達缺失的細胞基因轉導效率低下。因此研究非CAR受體依賴的、高效、低毒及簡單易行的促進rAdv基因轉導效率的方法十分必要。
　　 殼聚糖是一種天然的陽離子多糖，具有無毒、生物

2、相容性好、生物可降解及無免疫原性等多種優(yōu)點。但是其在生理pH條件下(pH7.4)不溶的特性限制了其生物學應用。已有的殼聚糖促進rAdv基因轉導效率的實驗需要特殊的酸性pH條件(pH6.4)，限制了其應用，需要開發(fā)新的方法。鑒此，本研究擬探索在生理pH條件下促進rAdv的基因轉導效率新的殼聚糖溶解方法，闡明其促進基因轉導能力，并在小鼠體內測試其促進口服rAdv免疫效果，為殼聚糖用于促進rAdv介導的基因治療和疫苗免疫效果提供基礎。

3、　　 本研究首先建立了促進殼聚糖在pH7.4條件下溶解的方法。經過大量篩選，我們發(fā)現利用NaHCO3溶液可以實現殼聚糖在生理pH條件下的溶解。結果顯示，該殼聚糖溶液具有明顯的生物學效應，可以在生理pH條件下顯著促進rAdv在多種細胞上的基因轉導效率。在CAR受體缺陷的細胞（CHO、DC2.4、RD、B16細胞系）中，殼聚糖碳酸氫鈉溶液可以將rAdv的基因轉導效率提高8～20倍；而在CAR受體高表達的細胞系(A549和HepⅡ)，殼聚糖

4、碳酸氫鈉溶液也可以將rAdv的基因轉導效率提高1.5倍左右。殼聚糖碳酸氫鈉溶液的促進轉導作用不受培養(yǎng)基中血清及rAdv純度的影響，對抗Ad5血清也有一定的耐受性。說明殼聚糖碳酸氫鈉溶液可以非CAR受體依賴、高效、低毒及簡便易行的促進rAdv基因轉導效率。
　　 在觀察了殼聚糖碳酸氫鈉溶液在體外促進rAdv基因轉導效率之后，我們觀察該新溶液是否具有在體應用的價值。我們發(fā)現在殼聚糖碳酸氫鈉溶液基礎上研制的殼聚糖制劑可以顯著提高rAd

5、v對模擬胃液環(huán)境的耐受性，且該作用可以被海藻糖進一步加強。相對于口服單獨給予表達輪狀病毒VP6基因的重組腺病毒(rAdv-VP6)疫苗，口服給予小鼠rAdv-VP6疫苗的殼聚糖制劑可以顯著提高免疫后小鼠血清抗體陽轉率以及抗體滴度，并可誘導粘膜器官抗原特異性IgA反應。輪狀病毒攻擊保護試驗證實其能顯著降低輪狀病毒攻擊后小鼠糞便中的排毒量。結果表明，該殼聚糖制劑可以顯著提高口服rAdv-VP6的免疫效果及攻毒保護效果。
　　 綜上所