基于核酸適配體的乳腺癌靶向治療系統(tǒng)的構(gòu)建及多壁碳納米管間接毒性的體外研究.pdf

1、第一部分，基于核酸適配體的乳腺癌靶向治療研究
　　 乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其中約20～30％為HER2陽(yáng)性。HER2陽(yáng)性的乳腺癌侵襲性強(qiáng)，預(yù)后差，且易對(duì)內(nèi)分泌治療和化療產(chǎn)生抵抗。雖然曲妥珠單抗可以靶向性地治療HER2陽(yáng)性的乳腺癌，但該治療對(duì)相當(dāng)一部分患者無效，且有效患者中的絕大多數(shù)很快會(huì)發(fā)生獲得性耐藥。因此，研發(fā)新型的針對(duì)HER2的靶向治療策略，具有較為重大的醫(yī)學(xué)意義。核酸適配體(aptamer)在構(gòu)建新型腫瘤靶向治療

2、體系方面，有較大的應(yīng)用潛能。但迄今為止，應(yīng)用HER2適配體來構(gòu)建乳腺癌靶向治療體系的研究，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本課題利用SELEX技術(shù)，以HER2表位肽為靶標(biāo)，篩選到了一種全新的針對(duì)HER2的DNA適配體，以此適配體為基礎(chǔ)構(gòu)建了靶向HER2的載細(xì)胞毒藥物體系，并在體外對(duì)該靶向載藥模型進(jìn)行了初步評(píng)估。主要研究工作如下：
　　 1．利用SELEX技術(shù)，以HER2表位肽為靶標(biāo)，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)每輪篩選中適配體庫(kù)的富集程度和HER2適配體的

3、相對(duì)親和力，我們篩選到了一種全新的HER2適配體(HB5)。該適配體含86個(gè)堿基，與HER2多肽的親和系數(shù)為18.9nm。
　　 2．為評(píng)估適配體HB5與HER2結(jié)構(gòu)的結(jié)合特異性，我們以隨機(jī)DNA庫(kù)作對(duì)照，利用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估了FITC標(biāo)記的HB5與HER2蛋白、胰酶和BSA的結(jié)合情況。結(jié)果顯示，HB5能夠選擇性的結(jié)合HER2蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域，但基本不結(jié)合BSA和胰酶。
　　 3．為評(píng)估適配體HB5與HER2陽(yáng)性或HER2

4、陰性細(xì)胞的結(jié)合性質(zhì)，我們將FITC標(biāo)記的HB5分別與多種HER2陽(yáng)性或HER2陰性細(xì)胞孵育，并行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。結(jié)果顯示，HB5能夠選擇性的結(jié)合HER2陽(yáng)性的乳腺癌腫瘤細(xì)胞系，而基本不結(jié)合HER2陰性的細(xì)胞系。
　　 4．通過將阿霉素(Dox)嵌入適配體的DNA結(jié)構(gòu)中，我們構(gòu)建了HER2適配體-陋J霉素(Apt-Dox)靶向載藥系統(tǒng)，并利用阿霉素嵌入DNA結(jié)構(gòu)中后其自發(fā)熒光淬滅的原理，對(duì)優(yōu)化該系統(tǒng)的參數(shù)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，當(dāng)適

5、配體與阿霉素的摩爾比為0.1時(shí)，阿霉素的自發(fā)熒光基本淬滅，提示大部分阿霉素已經(jīng)嵌入HB5的DNA結(jié)構(gòu)并與適配體形成了復(fù)合體。
　　 5．為在體外評(píng)估Apt-Dox靶向體系的有效性，我們用Apt-Dox，Apt和Dox，分別與HER2陽(yáng)性或HER2陰性的腫瘤細(xì)胞共孵育，利用激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)和MTS法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，Apt-Dox能夠被HER2陽(yáng)性細(xì)胞選擇性地?cái)z入，并且降低了Dox對(duì)HER2陰性細(xì)胞的殺傷作用(p＜0

6、.05)。
　　 本研究首次以HER2表位肽為靶點(diǎn)，篩選出了能夠結(jié)合HER2蛋白及HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的DNA適配體HB5。相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HER2適配體可以靶向性地將阿霉素帶入HER2陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞。鑒于多種惡性腫瘤（乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、食管癌和膀胱癌等）都可能過量表達(dá)HER2，HER2適配體有可能在針對(duì)這些腫瘤的新型靶向診療技術(shù)方面，具備一定的應(yīng)用潛能。
　　 第二部分，多壁碳納米管間接毒性

7、的體外研究
　　 碳納米管作為一種重要而有代表性的納米材料，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值，其生物安全性越來越受到關(guān)注。免疫系統(tǒng)在疾病發(fā)生過程中會(huì)導(dǎo)致組織損傷，因此非常有必要探索碳納米管是否能夠通過影響免疫功能而產(chǎn)生毒性。本研究主要在體外評(píng)估了人淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的碳納米管毒性，發(fā)現(xiàn)低濃度的碳納米管(0．001-0.1ug／ml)不會(huì)直接引起明顯的細(xì)胞死亡或凋亡，但是能夠增強(qiáng)淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用殺傷多種腫瘤細(xì)胞系。此外，碳納米管