翠綠針毛蕨化學(xué)成分及其抗腫瘤活性的研究.pdf

1、翠綠針毛蕨Macrothelypteris viridifrons(Tagawa) Ching是金星蕨科針毛蕨屬植物,廣泛分布于長(zhǎng)江流域以南各省區(qū),具有清熱解毒,利尿,止血等功效。目前,國(guó)內(nèi)外有關(guān)其化學(xué)成分和生物活性的報(bào)道很少,為了開發(fā)翠綠針毛蕨的藥用價(jià)值和研究其生物活性,本文對(duì)翠綠針毛蕨總黃酮活性部位的純化工藝、化學(xué)成分及抗腫瘤作用進(jìn)行了研究,同時(shí),對(duì)新化合物DHEC抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行了探討,并建立了翠綠針毛蕨藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2、　　在對(duì)總黃酮純化工藝的研究中,采用堿溶酸沉法結(jié)合大孔樹脂純化法,建立了翠綠針毛蕨總黃酮的純化工藝,最終得到轉(zhuǎn)移率不低于59.52％,純度不低于54.85％的翠綠針毛蕨總黃酮。最佳提取工藝為:以70％乙醇為溶劑,料液比1:20,80℃下回流提取2次,每次60min;最佳純化工藝為:堿溶酸沉法(堿液溶解最佳pH值為7.0,酸液沉淀最佳pH值為1.0-2.0);大孔樹脂法(選用HPD500樹脂,上樣液pH值為5.0,上樣液濃度為4.0mg/

3、mL,吸附流速為2.0BV/h,洗脫劑為70％乙醇,洗脫劑體積為3.0BV,洗脫流速為2.0BV/h)。
　　通過(guò)體內(nèi)外抗腫瘤活性的對(duì)比研究,結(jié)果顯示翠綠針毛蕨總黃酮可顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖以及小鼠S180肉瘤模型腫瘤的生長(zhǎng),其活性明顯優(yōu)于總提取物。另外,以HepG2人肝癌細(xì)胞為模型,采用MTT法評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖,PI染色法檢測(cè)細(xì)胞周期,Annexin V-FITC/PI雙染法和Hoechst33258熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡等手段

4、來(lái)進(jìn)一步研究總黃酮的體外抗腫瘤作用,結(jié)果顯示翠綠針毛蕨總黃酮可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡,且能使細(xì)胞周期停滯于G2/M期。同時(shí),在小鼠H22肝癌模型中,采用抑瘤率,生化指標(biāo)檢測(cè),HE染色,免疫組化等方法來(lái)深入分析翠綠針毛蕨總黃酮的抗腫瘤作用,結(jié)果顯示翠綠針毛蕨總黃酮可以顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng),且對(duì)血管形成具有一定的抑制作用,提示其作用機(jī)制可能與抑制腫瘤組織血管生成和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　在總黃酮化學(xué)成分研究中,采用現(xiàn)代色譜和光譜技術(shù)

5、,從翠綠針毛蕨總黃酮中分離得到19個(gè)化合物,其中9個(gè)是結(jié)構(gòu)新穎罕見的B環(huán)非苯環(huán)的黃酮類化合物,包括1個(gè)新化合物8,分別為5,7-二羥基色原酮(1);5,7-二羥基-2-(1-羥基-2,6-二甲氧基-4-酮-環(huán)己烷)-色原酮(2);5,7-二羥基-2-(1,2-異丙二氧基-4-酮-環(huán)己-5-烯)-色原酮(3);原芹菜素(4);芹菜素(5);柚皮素(6);山奈酚(7);2-(順-1,2-二羥基-4酮-環(huán)己-5-烯)-5-羥基-7-乙氧基色原

6、酮(8);2-(順-1,2-二羥基-4-酮-環(huán)己-5-烯)-5,7-二羥基-色原酮(9);槲皮素(10);2-(反-1,4-二羥基環(huán)己烷)-5,7-二羥基-色原酮(11);5,7-二羥基-2-(1,4-二羥基-環(huán)己-2,5-二烯)-色原酮(12);芹菜素-4'-葡萄糖苷(13);柚皮素-4'-葡萄糖苷(14);山奈酚-3-葡萄糖苷(15);5,7-二羥基-2-(1,4-二羥基環(huán)己烷)-色原酮-4'-O-葡萄糖苷(16);4'-羥基原芹菜

7、素-4'-葡萄糖苷(17);山奈酚-3-蘆丁糖苷(18);槲皮素-3-蘆丁糖苷(19)。所有化合物均為首次從該植物中分離得到。
　　同時(shí),采用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、熒光顯微鏡、免疫印跡實(shí)驗(yàn)等方法對(duì)新化合物2-(順-1,2-二羥基-4酮-環(huán)己-5-烯)-5-羥基-7-乙氧基色原酮(DHEC)誘導(dǎo)HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行了深入探討,結(jié)果顯示DHEC能顯著抑制HT-29細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡,并能引起線粒體內(nèi)膜電位(MMP)顯

8、著降低,細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的異常升高,細(xì)胞色素C的大量釋放,PARP、procaspase-3、-8、-9的活化裂解,促凋亡蛋白Bax和Bad蛋白表達(dá)顯著增加,抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl表達(dá)顯著降低;同時(shí),引起MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的3個(gè)成員(ERK、JNK、P38 MAPK)發(fā)生磷酸化激活;所有結(jié)果表明DHEC可經(jīng)凋亡途徑抑制HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖,其中ROS介導(dǎo)的,Bcl-2家族蛋白調(diào)控的,Caspase途徑依賴的