微囊化人降鈣素基因修飾細(xì)胞治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的研究.pdf

1、背景:原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥為一種以骨量減少,骨微結(jié)構(gòu)破壞,導(dǎo)致骨脆性增加,容易發(fā)生骨折為特征的全身代謝性骨病。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是最常見的一種原發(fā)性骨質(zhì)疏松,該病的致殘率及致死率較高,是嚴(yán)重威脅老年人生存質(zhì)量的多發(fā)病,由此產(chǎn)生的醫(yī)療費(fèi)用成為家庭和社會(huì)的沉重負(fù)擔(dān)。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥其特征是多在絕經(jīng)后5～10年內(nèi)發(fā)病,主要由絕經(jīng)后雌激素減少引起。雌激素水平低下時(shí)骨轉(zhuǎn)換速度加快。在骨重建高轉(zhuǎn)換狀態(tài)下,破骨細(xì)胞骨吸收形成的陷窩得不到充分的骨形成修復(fù),骨

2、小梁可穿孔、斷裂,不連接的小梁數(shù)增多,是導(dǎo)致絕經(jīng)后骨量大量流失和骨質(zhì)量降低的主要病理機(jī)制。絕經(jīng)后骨代謝為高轉(zhuǎn)換型,骨吸收大于骨形成,因而發(fā)生骨量丟失。應(yīng)用骨吸收抑制劑是合理的用藥選擇。骨吸收抑制劑主要有雌激素類、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雙膦酸鹽類及降鈣素類等。其中降鈣素主要由哺乳動(dòng)物甲狀腺旁濾泡細(xì)胞(C細(xì)胞)分泌的多肽類激素,由32個(gè)氨基酸組成。降鈣素對(duì)骨的作用是抑制破骨細(xì)胞的活性和增生,從而抑制骨吸收,降低骨轉(zhuǎn)換率。因此降鈣素作為抗骨

3、吸收藥物在骨質(zhì)疏松癥臨床治療中得以廣泛應(yīng)用。盡管降鈣素在治療骨代謝疾病方面效果良好,但是降鈣素與絕經(jīng)后骨量丟失之間的關(guān)系,尚存在爭(zhēng)議。降鈣素在體內(nèi)的半衰期短,要達(dá)臨床滿意效果,必須長(zhǎng)期反復(fù)應(yīng)用。這使很多病人難以堅(jiān)持。而且此類藥物有一定的抗原性,限制其臨床應(yīng)用。
　　目的:本研究首先擬觀察去勢(shì)大鼠基礎(chǔ)值及其儲(chǔ)備功能的改變;同時(shí)了解體內(nèi)甲狀腺C細(xì)胞形態(tài)變化特點(diǎn)。為進(jìn)一步探討降鈣素在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生中的作用提供試驗(yàn)依據(jù)。同時(shí),擬微囊

4、技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合起來(lái),通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法建立降鈣素基因高表達(dá)成肌細(xì)胞株,再將其微囊化,形成微囊化轉(zhuǎn)降鈣素基因修飾細(xì)胞。觀察重組人降鈣素對(duì)體外骨重建功能細(xì)胞的影響。進(jìn)而將微囊化轉(zhuǎn)基因修飾細(xì)胞移植體內(nèi),觀察對(duì)去勢(shì)大鼠的骨代謝與骨結(jié)構(gòu)的影響。
　　方法:6月齡清潔級(jí)健康雌性SD大鼠16只,隨機(jī)均分為去卵巢組和假手術(shù)組。去勢(shì)12周后用鈣負(fù)荷-降鈣素興奮試驗(yàn)分別觀察兩組降鈣素基礎(chǔ)值及其儲(chǔ)備功能的改變。并處死每組大鼠,留取甲狀腺組織,采用

5、免疫組織化學(xué)方法顯示降鈣素陽(yáng)性細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)計(jì)量學(xué)分析。另外,利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將人降鈣素基因(hCT)轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞,以G418篩選出陽(yáng)性克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)。用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、Western Blot和免疫組織化學(xué)分析目的基因及其蛋白表達(dá);并用ELISA法檢測(cè)上清中分泌的人降鈣素濃度。將轉(zhuǎn)染有hCT cDNA的L6成肌細(xì)胞包被在具有免疫隔離作用的海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉(APA)微囊內(nèi)形成微囊化基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

6、在體外培養(yǎng)的同時(shí),應(yīng)用原代培養(yǎng)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞方法,觀察重組人降鈣素對(duì)細(xì)胞形態(tài)、功能的影響。而后將微囊化基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞移植到大鼠的腹腔,連續(xù)測(cè)定腰椎骨密度、腰椎和股骨骨生物力學(xué)性能和骨代謝生化指標(biāo)改變,光鏡及電鏡觀察骨組織病理改變并進(jìn)行形態(tài)計(jì)量學(xué)分析, ELISA法檢測(cè)血清人降鈣素濃度。探討研究植入微囊化的人降鈣素(hCT)cDNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)去勢(shì)大鼠的治療效果,為臨床應(yīng)用基因工程細(xì)胞治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松提供新方法。
　　結(jié)果:⑴大鼠

7、切除卵巢后12周,骨小梁數(shù)目減少,纖細(xì),相互連接減弱,成功復(fù)制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型。去勢(shì)大鼠體內(nèi)降鈣素基礎(chǔ)值及其儲(chǔ)備功能均低于對(duì)照組;體內(nèi)甲狀腺C細(xì)胞數(shù)目劇增。
　?、脐?yáng)性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將含人降鈣素表達(dá)基因的質(zhì)粒導(dǎo)入成肌細(xì)胞,G418加壓篩選。RT-PCR檢測(cè)從mRNA的水平證實(shí)染后的成肌細(xì)胞中有外源性人降鈣素基因的轉(zhuǎn)錄;通過(guò)western blot和免疫組化的方法證實(shí)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞有人降鈣素蛋白表達(dá)的同時(shí),ELISA法也可從五株抗

8、性克隆培養(yǎng)上清中檢測(cè)到一定水平的hCT,與對(duì)照組克隆相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞可以將胞質(zhì)中合成的降鈣素分泌至細(xì)胞外。
　?、窃隗w外、體內(nèi)檢測(cè)到人降鈣素的持續(xù)分泌,說(shuō)明重組人降鈣素可滲透通過(guò)微囊壁,進(jìn)而發(fā)揮其生理作用。
　?、戎亟M人降鈣素顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的增殖、堿性磷酸酶的活性和礦化功能;呈劑量依賴關(guān)系。
　　⑸重組人降鈣素可減少破骨細(xì)胞數(shù)和骨吸收陷窩面積;呈劑量依賴性。
　?、手踩胛⒛一?/p>

9、人降鈣素轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,去勢(shì)大鼠骨轉(zhuǎn)換率下降,改善骨小梁微結(jié)構(gòu),腰椎骨量和骨強(qiáng)度明顯改善。對(duì)脛骨的松質(zhì)骨量,部分地或有限度地防止骨丟失。
　　結(jié)論:⑴去勢(shì)后大鼠甲狀腺C細(xì)胞的分泌功能失代償也許是骨量降低的原因之一。
　?、莆⒛一痟CT cDNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞能合成和向囊外分泌人降鈣素。
　　⑶重組人降鈣素對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化功能有明顯促進(jìn)作用;可減少破骨細(xì)胞的數(shù)量,抑制其骨吸收功能。
　?、任⒛一D(zhuǎn)基因修飾