脂肪干細(xì)胞載荷的靜電紡絲納米纖維膜層層組裝構(gòu)建的三維支架修復(fù)顱骨缺損的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第1章 大鼠腹股溝皮下脂肪來源的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定及成骨效果研究
　　目的:對(duì)大鼠腹股溝皮下脂肪來源的ADSCs進(jìn)行鑒定，明確所獲得的ADSCs的純度，并對(duì)ADSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，明確大鼠腹股溝部脂肪來源的ADSCs的成骨效果。
　　方法:3只2個(gè)月大小，平均體重為227g±14.8g的SD大鼠（購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），經(jīng)腹腔注射麻醉后，常規(guī)手術(shù)操作切取大鼠腹股溝皮

2、下脂肪組織。對(duì)脂肪組織進(jìn)行剪切、消化、提取ADSCs進(jìn)行原代培養(yǎng)。所得ADSCs進(jìn)行以下檢測:(1)顯微鏡下細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察;(2)第4代的ADSCs應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD29、CD90、CD49d、CD45、CD11b及CD106各表面標(biāo)志物，對(duì)ADSCs進(jìn)行鑒定，并確定其純度;(3)對(duì)所獲得的ADSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，應(yīng)用堿性磷酸酶(ALP)染色及Alizarin red（茜素紅）染色檢測其成骨分化能力。
　　結(jié)果:(1)顯

3、微鏡下ADSCs大小約50-100μm，細(xì)胞較大，核大居中，胞漿豐富，細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞長長融合后呈梭形漩渦狀排列。(2) ADSCs的流式細(xì)胞術(shù)檢測:特征性表面抗體陽性率為CD29(99.65％)，CD90(68.38％)及CD49d(86.82％)，ADSCs非特征性抗體的陽性率:CD45(0.06％)，CD11b(0.24％)及CD106(0.84％)。(3)ALP染色結(jié)果示:成骨誘導(dǎo)后的ADSCs染成灰色，結(jié)果陽性。茜素紅染色結(jié)

4、果顯示:ADSCs大范圍紅染，視野內(nèi)可見多量呈紅色深染的礦化結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)散在分布，中心部顏色較深。
　　結(jié)論:(1) ADSCs來源豐富、容易獲得、取材簡單，易于培養(yǎng)，無需特殊培養(yǎng)條件，這均為其應(yīng)用提供了有利條件;(2)我們提取的大鼠腹股溝皮下ADSCs的形態(tài)及表型符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征;(3)我們所提取的大鼠腹股溝皮下ADSCs純度較高，可應(yīng)用于組織工程的研究;(4)大鼠腹股溝皮下ADSCs具有良好的成骨分化功能。
　　第2

5、章 靜電紡絲納米纖維膜支架的構(gòu)建、生物特性檢測及其體外促進(jìn)ADSCs成骨分化的效果
　　目的:本研究應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建靜電紡絲納米纖維膜，檢測其生物相容性及細(xì)胞在膜上的增殖及成骨分化情況，應(yīng)用納米纖維膜層層組裝構(gòu)建三維支架，檢測ADSCs在該三維支架內(nèi)的成骨效果。
　　方法:本研究以PCL及gelatin為材料，分別以10％濃度溶于三氟乙醇溶劑，然后將兩溶液以1∶1比例混合，利用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建納米纖維膜(nanofibe

6、r membrane，NFM)。(1)對(duì)該納米纖維膜的形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察及檢測;(2)將ADSCs種植于NFM上，觀察NFM的生物相容性，并檢測ADSCs在NFM層層組裝的三維支架上的增殖情況，采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及應(yīng)用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)比較兩組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)增殖的差異;(3)應(yīng)用掃描電鏡觀察NFM的纖維結(jié)構(gòu)，并測量其纖維直徑大小，掃描電鏡下觀察細(xì)胞在NFM上的生長情況;(4)應(yīng)用Live/Dead染色技術(shù)以檢測ADSCs

7、在NFM三維支架內(nèi)的存活情況;(5)將ADSCs載荷的NFM膜在體外進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，進(jìn)行成骨相關(guān)蛋白的熒光染色，檢測成骨相關(guān)蛋白即骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)、骨橋蛋白（osteopotin，OPN）與骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:(1)形態(tài)學(xué)觀察:NFM厚度約為50μm，具有一定的機(jī)械性能;(2)掃描電鏡下觀察可見NFM纖維直徑總體均勻，少部分纖維直徑相差懸殊，纖維直徑大約

8、是500-1500nm，納米纖維相互交錯(cuò)，呈不同立體結(jié)構(gòu)，纖維間有大小約10-50μm左右的孔隙，孔隙間相通。NFM上可見ADSCs生長，細(xì)胞伸展，呈多角形，細(xì)胞與纖維之間聯(lián)系緊密，有些兩者融合，細(xì)胞胞體能部分長入納米纖維膜的孔隙內(nèi)。(3) ADSCs能在NFM上快速增殖，于24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)后顯著高于對(duì)照組（t48h=-7.723，P48h=0.002; t72h=-14.912，P72h＜0.001，F(xiàn)分組=1451.881，P分組＜0

9、.001，F(xiàn)時(shí)間=69.878，P時(shí)間＜0.001。交互效應(yīng):F=48.482，P＜0.001）。(4) ADSCs種植于NFM上后，2周及4周時(shí)間點(diǎn)時(shí)，對(duì)樣本進(jìn)行免疫熒光染色，2周時(shí)結(jié)果顯示細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)OCN、OPN、OPG蛋白均有顯色，示有相應(yīng)蛋白的分泌，但表達(dá)量較低，4周時(shí)以上各蛋白表達(dá)量均明顯高于2周時(shí)的蛋白分泌量;(5)將ADSCs載荷的NFM進(jìn)行層層組裝（3層）并進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，于1、2、3及4周四個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別檢測各組基因

10、表達(dá)情況，結(jié)果示3周及4周時(shí)間點(diǎn)時(shí)，ADSCs-NFM成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基組的基因表達(dá)OCN(F3w=54.049，P3w＜0.001;F4w=60.811,P4w＜0.001)、OPN(F3w=47.975，P3w＜0.001; F4w=67.588,P4w＜0.001)、OPG(F3w=28.306，P3w=0.001;F4w=151.551，P4w=0.001,)、BSP(F3w=84.607，P3w＜0.001; F4w=216.21

11、9,P4w＜0.001)、RUNX2(F3w=10.950,P3w=0.003; F4w=4655.158,P4w＜0.001)及OSX(F3w=2314.216，P3w＜0.001;F4w=1405.869，P4w＜0.001)顯著高于其余各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:(1) PCL及gelatin所構(gòu)建的NFM生相容性好，細(xì)胞能夠很好的貼附于支架上，細(xì)胞在NFM上生長良好;(2) PCL及gelatin所構(gòu)建的NFM有較

12、大的孔隙率，此結(jié)構(gòu)有助于營養(yǎng)擴(kuò)散及產(chǎn)物排出;其纖維結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)相似，可用作為細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞生長;(3) ADSCs能在NFM上生長良好，在誘導(dǎo)情況下能表達(dá)成骨相關(guān)蛋白（OCN，OPN及OPG）;(4)ADSCs載荷NFM構(gòu)建的三維支架結(jié)構(gòu)能促進(jìn)ADSCs向成骨細(xì)胞分化并促進(jìn)表達(dá)相應(yīng)成骨基因表達(dá)，促進(jìn)成骨發(fā)生。
　　第3章 ADSCs載荷的NFM層層組裝構(gòu)建的3維支架修復(fù)大鼠顱骨缺損
　　目的:本研究將ADSCs載荷

13、的NFM層層組裝構(gòu)建的3維支架應(yīng)用于修復(fù)大鼠顱骨缺損，明確其在大鼠體內(nèi)的成骨效果。
　　方法:(1)按第二部分所述的方法，將ADSCs種植于NFM上進(jìn)行層層組裝構(gòu)建ADSCs載荷的NFM層層組裝3維支架;(2)將以上3維支架種植于大鼠顱骨缺損部位，術(shù)后12周取材，并對(duì)大體標(biāo)本進(jìn)行觀察;(3)應(yīng)用micro-CT方法對(duì)以上所有樣本進(jìn)行掃描，明確所有樣品再生骨組織的骨礦物質(zhì)密度，對(duì)樣品進(jìn)行三維重建明確骨修復(fù)的情況;(4)應(yīng)用HE染色及

14、Masson染色比較各組樣品骨修復(fù)情況的差異;(5)各組樣品進(jìn)行RT-qPCR檢測，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行對(duì)比，明確各組在各成骨相關(guān)基面表達(dá)上的差異。
　　結(jié)果:(1)各組樣品大體結(jié)果示:ADSCs載荷的NFM層層組裝修復(fù)組的顱骨缺損樣品表面平整，已無缺損殘留，其對(duì)顱骨缺損的修復(fù)效果最好。(2) micro-CT檢查結(jié)果示ADSCs載荷的NFM層層組裝修復(fù)組的再生骨組織的礦物質(zhì)密度為823.047±47.010mg/c

15、m3，較其他兩組再生骨組織的礦物質(zhì)密度高（缺損組的BMD58.348±4.435，NFM組的BMD為610.666±51.733，ADSC-NFM組的BMD為823.047±47.010，三者比較F=857.565，P＜0.001，差異較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。三維重建結(jié)果示該組的原顱骨缺損區(qū)域已大部分修復(fù)，且修復(fù)組織無顯著臺(tái)階感。(3) HE染色及Masson染色結(jié)果均示ADSCs載荷的NFM層層組裝修復(fù)組生成的骨組織最多，結(jié)構(gòu)與正常骨相

16、似，其修復(fù)效果最好。(4)各組樣品進(jìn)行RT-qPCR檢測，各成骨相關(guān)基因表達(dá)示ADSCs載荷的NFM層層組裝修復(fù)組的成骨基因表達(dá)均高于顱骨缺損組OCN(t=13.355，P=0.006)、OPN(t=22.535，P=0.002)、 OPG(t=22.67,P=0.002);BSP(t=24.268,PBSP=0.002)、RUNX2(t=8.510,P=0.014)、OSX(t=12.722,P=0.006)及層層組裝的NFM修復(fù)組即

17、NFM組的OCN（t=-7.815，P=0.001）、OPN(t=-10.288,P=0.002)、OPG(t=-5.528,P=0.05)、BSP(t=-22.721,P＜0.001)、RUNX2(t=-7.053,P=0.001)及OSX(t=-9.441,P=0.001)。
　　結(jié)論:(1)ADSCs可以在NFM層層組裝3D支架上分化促時(shí)成骨相關(guān)基因蛋白的表達(dá)，促進(jìn)骨的形成;(2)ADSCs載荷的NFM層層組裝的三維支架材料