脂肪干細胞載荷的靜電紡絲納米纖維膜層層組裝構建的三維支架修復顱骨缺損的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第1章 大鼠腹股溝皮下脂肪來源的脂肪間充質(zhì)干細胞的鑒定及成骨效果研究
　　目的:對大鼠腹股溝皮下脂肪來源的ADSCs進行鑒定，明確所獲得的ADSCs的純度，并對ADSCs進行成骨誘導培養(yǎng)，明確大鼠腹股溝部脂肪來源的ADSCs的成骨效果。
　　方法:3只2個月大小，平均體重為227g±14.8g的SD大鼠（購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心），經(jīng)腹腔注射麻醉后，常規(guī)手術操作切取大鼠腹股溝皮

2、下脂肪組織。對脂肪組織進行剪切、消化、提取ADSCs進行原代培養(yǎng)。所得ADSCs進行以下檢測:(1)顯微鏡下細胞的形態(tài)學觀察;(2)第4代的ADSCs應用流式細胞術檢測CD29、CD90、CD49d、CD45、CD11b及CD106各表面標志物，對ADSCs進行鑒定，并確定其純度;(3)對所獲得的ADSCs進行成骨誘導培養(yǎng)，應用堿性磷酸酶(ALP)染色及Alizarin red（茜素紅）染色檢測其成骨分化能力。
　　結果:(1)顯

3、微鏡下ADSCs大小約50-100μm，細胞較大，核大居中，胞漿豐富，細胞呈多角形，細胞長長融合后呈梭形漩渦狀排列。(2) ADSCs的流式細胞術檢測:特征性表面抗體陽性率為CD29(99.65％)，CD90(68.38％)及CD49d(86.82％)，ADSCs非特征性抗體的陽性率:CD45(0.06％)，CD11b(0.24％)及CD106(0.84％)。(3)ALP染色結果示:成骨誘導后的ADSCs染成灰色，結果陽性。茜素紅染色結

4、果顯示:ADSCs大范圍紅染，視野內(nèi)可見多量呈紅色深染的礦化結節(jié)，結節(jié)散在分布，中心部顏色較深。
　　結論:(1) ADSCs來源豐富、容易獲得、取材簡單，易于培養(yǎng)，無需特殊培養(yǎng)條件，這均為其應用提供了有利條件;(2)我們提取的大鼠腹股溝皮下ADSCs的形態(tài)及表型符合間充質(zhì)干細胞的特征;(3)我們所提取的大鼠腹股溝皮下ADSCs純度較高，可應用于組織工程的研究;(4)大鼠腹股溝皮下ADSCs具有良好的成骨分化功能。
　　第2

5、章 靜電紡絲納米纖維膜支架的構建、生物特性檢測及其體外促進ADSCs成骨分化的效果
　　目的:本研究應用靜電紡絲技術構建靜電紡絲納米纖維膜，檢測其生物相容性及細胞在膜上的增殖及成骨分化情況，應用納米纖維膜層層組裝構建三維支架，檢測ADSCs在該三維支架內(nèi)的成骨效果。
　　方法:本研究以PCL及gelatin為材料，分別以10％濃度溶于三氟乙醇溶劑，然后將兩溶液以1∶1比例混合，利用靜電紡絲技術構建納米纖維膜(nanofibe

6、r membrane，NFM)。(1)對該納米纖維膜的形態(tài)學進行觀察及檢測;(2)將ADSCs種植于NFM上，觀察NFM的生物相容性，并檢測ADSCs在NFM層層組裝的三維支架上的增殖情況，采用析因設計資料的方差分析方法進行統(tǒng)計分析及應用兩獨立樣本的t檢驗比較兩組4個時間點增殖的差異;(3)應用掃描電鏡觀察NFM的纖維結構，并測量其纖維直徑大小，掃描電鏡下觀察細胞在NFM上的生長情況;(4)應用Live/Dead染色技術以檢測ADSCs

7、在NFM三維支架內(nèi)的存活情況;(5)將ADSCs載荷的NFM膜在體外進行成骨誘導，進行成骨相關蛋白的熒光染色，檢測成骨相關蛋白即骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)、骨橋蛋白（osteopotin，OPN）與骨保護素(osteoprotegerin，OPG)的表達情況。
　　結果:(1)形態(tài)學觀察:NFM厚度約為50μm，具有一定的機械性能;(2)掃描電鏡下觀察可見NFM纖維直徑總體均勻，少部分纖維直徑相差懸殊，纖維直徑大約

8、是500-1500nm，納米纖維相互交錯，呈不同立體結構，纖維間有大小約10-50μm左右的孔隙，孔隙間相通。NFM上可見ADSCs生長，細胞伸展，呈多角形，細胞與纖維之間聯(lián)系緊密，有些兩者融合，細胞胞體能部分長入納米纖維膜的孔隙內(nèi)。(3) ADSCs能在NFM上快速增殖，于24小時時間點后顯著高于對照組（t48h=-7.723，P48h=0.002; t72h=-14.912，P72h＜0.001，F(xiàn)分組=1451.881，P分組＜0

9、.001，F(xiàn)時間=69.878，P時間＜0.001。交互效應:F=48.482，P＜0.001）。(4) ADSCs種植于NFM上后，2周及4周時間點時，對樣本進行免疫熒光染色，2周時結果顯示細胞外基質(zhì)內(nèi)OCN、OPN、OPG蛋白均有顯色，示有相應蛋白的分泌，但表達量較低，4周時以上各蛋白表達量均明顯高于2周時的蛋白分泌量;(5)將ADSCs載荷的NFM進行層層組裝（3層）并進行成骨誘導培養(yǎng)，于1、2、3及4周四個時間點分別檢測各組基因

10、表達情況，結果示3周及4周時間點時，ADSCs-NFM成骨誘導培養(yǎng)基組的基因表達OCN(F3w=54.049，P3w＜0.001;F4w=60.811,P4w＜0.001)、OPN(F3w=47.975，P3w＜0.001; F4w=67.588,P4w＜0.001)、OPG(F3w=28.306，P3w=0.001;F4w=151.551，P4w=0.001,)、BSP(F3w=84.607，P3w＜0.001; F4w=216.21

11、9,P4w＜0.001)、RUNX2(F3w=10.950,P3w=0.003; F4w=4655.158,P4w＜0.001)及OSX(F3w=2314.216，P3w＜0.001;F4w=1405.869，P4w＜0.001)顯著高于其余各組，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結論:(1) PCL及gelatin所構建的NFM生相容性好，細胞能夠很好的貼附于支架上，細胞在NFM上生長良好;(2) PCL及gelatin所構建的NFM有較

12、大的孔隙率，此結構有助于營養(yǎng)擴散及產(chǎn)物排出;其纖維結構與細胞外基質(zhì)相似，可用作為細胞外基質(zhì)，促進細胞生長;(3) ADSCs能在NFM上生長良好，在誘導情況下能表達成骨相關蛋白（OCN，OPN及OPG）;(4)ADSCs載荷NFM構建的三維支架結構能促進ADSCs向成骨細胞分化并促進表達相應成骨基因表達，促進成骨發(fā)生。
　　第3章 ADSCs載荷的NFM層層組裝構建的3維支架修復大鼠顱骨缺損
　　目的:本研究將ADSCs載荷

13、的NFM層層組裝構建的3維支架應用于修復大鼠顱骨缺損，明確其在大鼠體內(nèi)的成骨效果。
　　方法:(1)按第二部分所述的方法，將ADSCs種植于NFM上進行層層組裝構建ADSCs載荷的NFM層層組裝3維支架;(2)將以上3維支架種植于大鼠顱骨缺損部位，術后12周取材，并對大體標本進行觀察;(3)應用micro-CT方法對以上所有樣本進行掃描，明確所有樣品再生骨組織的骨礦物質(zhì)密度，對樣品進行三維重建明確骨修復的情況;(4)應用HE染色及

14、Masson染色比較各組樣品骨修復情況的差異;(5)各組樣品進行RT-qPCR檢測，采用獨立樣本t檢驗的統(tǒng)計學方法進行對比，明確各組在各成骨相關基面表達上的差異。
　　結果:(1)各組樣品大體結果示:ADSCs載荷的NFM層層組裝修復組的顱骨缺損樣品表面平整，已無缺損殘留，其對顱骨缺損的修復效果最好。(2) micro-CT檢查結果示ADSCs載荷的NFM層層組裝修復組的再生骨組織的礦物質(zhì)密度為823.047±47.010mg/c

15、m3，較其他兩組再生骨組織的礦物質(zhì)密度高（缺損組的BMD58.348±4.435，NFM組的BMD為610.666±51.733，ADSC-NFM組的BMD為823.047±47.010，三者比較F=857.565，P＜0.001，差異較有顯著統(tǒng)計學意義）。三維重建結果示該組的原顱骨缺損區(qū)域已大部分修復，且修復組織無顯著臺階感。(3) HE染色及Masson染色結果均示ADSCs載荷的NFM層層組裝修復組生成的骨組織最多，結構與正常骨相

16、似，其修復效果最好。(4)各組樣品進行RT-qPCR檢測，各成骨相關基因表達示ADSCs載荷的NFM層層組裝修復組的成骨基因表達均高于顱骨缺損組OCN(t=13.355，P=0.006)、OPN(t=22.535，P=0.002)、 OPG(t=22.67,P=0.002);BSP(t=24.268,PBSP=0.002)、RUNX2(t=8.510,P=0.014)、OSX(t=12.722,P=0.006)及層層組裝的NFM修復組即

17、NFM組的OCN（t=-7.815，P=0.001）、OPN(t=-10.288,P=0.002)、OPG(t=-5.528,P=0.05)、BSP(t=-22.721,P＜0.001)、RUNX2(t=-7.053,P=0.001)及OSX(t=-9.441,P=0.001)。
　　結論:(1)ADSCs可以在NFM層層組裝3D支架上分化促時成骨相關基因蛋白的表達，促進骨的形成;(2)ADSCs載荷的NFM層層組裝的三維支架材料