新型電紡取向納米紗-納米纖維三維組織工程纖維環(huán)支架的構建.pdf

1、椎間盤突出術后復發(fā)與纖維環(huán)破損及無法有效修復密切相關。組織工程技術可望有效修復纖維環(huán)，理想的組織工程移植物不但能夠功能性替換受損的纖維環(huán)組織而且能夠促進組織再生并恢復其應有的生物學功能。如何根據(jù)纖維環(huán)特殊結構進行組織工程支架的構建是制備修復材料的基礎。這些支架可以模擬體內(nèi)結構提供人造的細胞外基質(zhì)環(huán)境并為組織再生提供一個三維模板。靜電紡絲是目前構建組織工程支架的一種經(jīng)濟而有效的手段。靜電紡絲生成的納米纖維在尺寸上和體內(nèi)細胞外基質(zhì)的纖維尺寸

2、相似。納米或微米級的纖維能夠促進細胞增殖和新陳代謝，有助于細胞外基質(zhì)的分泌。目前靜電紡絲已經(jīng)廣泛應用于運動系統(tǒng)組織工程研究領域。通常情況下，人們使用平板收集靜電紡絲纖維，從而獲得無規(guī)納米纖維支架，具有各向同性的結構和力學特點。然而在人體中承擔復雜應力的纖維環(huán)組織，因其內(nèi)部膠原纖維的有序排列而具有明顯的各向異性力學特點。為模擬膠原纖維有序排列的結構特點，研究者提出很多方法來獲得有序排列的電紡纖維。最常見的方法是使用高速滾輪接收納米纖維。這

3、種方法制備的取向納米纖維支架具有各向異性的結構和力學特點，但由于纖維排列過于緊密，有礙細胞長入，限制了其進一步應用。本研究先使用聚左旋乳酸聚己內(nèi)酯為原料，構建了取向納米纖維支架，了解該支架的特性和存在的問題。而后使用自行設計的新型半自動靜電紡絲設備，構建取向納米紗/納米纖維三維復合支架來模擬單層纖維環(huán)的結構特點。我們對這種新型支架的結構、力學性能進行觀測，對支架內(nèi)細胞增殖和長入情況進行評估。結果提示該支架具有良好的力學性能和細胞導入能力

4、，可用于纖維環(huán)組織工程的進一步研究。
　　第一部分取向納米纖維組織工程纖維環(huán)支架的構建及驗證
　　目的:以聚左旋乳酸聚己內(nèi)酯(P(LLA-CL))為原料，使用靜電紡絲技術構建取向納米纖維支架。觀測其結構，測試該支架力學性能，觀察細胞在支架上的粘附與增值情況，評估其應用于纖維環(huán)組織工程研究的可行性。
　　方法:使用高速滾軸作為收集裝置構建取向納米纖維支架，使用掃描電鏡觀察其表面結構特點，使用拉伸力學實驗機測試其拉伸力學性

5、能。體外接種骨髓間充質(zhì)干細胞，觀察細胞在支架表面增殖和生長情況。使用無規(guī)納米纖維支架作為對照進行對比研究。
　　結果:制備的P(LLA-CL)取向納米纖維支架中納米纖維的排列具有良好的方向性，該支架在纖維排列方向上的拉伸力學強度得到明顯強化。骨髓間充質(zhì)干細胞可在支架表面增殖，細胞可沿納米纖維方向拉伸并定向排列。
　　結論:取向納米纖維支架的力學強度在納米纖維排列方向上得到了增強，具有和單層纖維環(huán)板層相似的各向異性結構和力學特

6、點，并能夠誘導細胞沿纖維方向定向排列，可作為纖維環(huán)組織工程研究的備選支架。
　　第二部分新型取向納米紗/納米纖維組織工程纖維環(huán)三維支架的構建及驗證
　　目的:模擬椎間盤纖維環(huán)細胞外基質(zhì)的組織結構特點，使用改進的新型半自動靜電紡絲設備，構建由取向納米紗和無規(guī)納米纖維構成的復合三維支架，觀察該支架的結構和力學特點，觀察支架與細胞之間的相互作用，評估其應用于纖維環(huán)組織工程研究中的價值。
　　方法:使用自行改進的半自動雙接收裝

7、置靜電紡絲設備制備了取向納米紗/納米纖維組織工程三維支架（ANYNFS）。使用聚左旋乳酸-聚己內(nèi)酯共聚物(P(LLA-CL))和絲素蛋白(SF)為原料進行支架構建，使用同種原料制備無規(guī)納米纖維支架（RNFS）和取向納米纖維支架(ANFS)進行對比研究。使用掃描電鏡觀察支架的表觀特征;使用透射電鏡觀察支架內(nèi)部結構;使用材料力學性能顯微測試系統(tǒng)對支架進行單軸拉伸力學測試。將大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)種植于支架表面，使用掃描電鏡和共聚

8、焦顯微鏡觀察細胞的粘附、增殖情況。使用雙鏈DNA檢測試劑盒檢測細胞在三種支架上的增殖速率;使用組織切片對支架內(nèi)細胞長入情況進行分析。
　　結果:使用新型電紡設備構建的ANYNFS由取向排列的納米紗和無規(guī)分布的納米纖維構成，具有三維空間結構。與RNFS和ANFS相比，該支架具有更大的孔徑和更高的孔隙率。拉伸力學結果顯示，ANYNFS的力學強度在平行于取向納米紗排列的方向上得到了明顯的增強，具有各向異性的力學特點。雙鏈DNA檢測試劑盒

9、檢測發(fā)現(xiàn)大鼠BMSCs在ANYNFS中增殖速率要明顯高于RNFS和ANFS，即ANYNFS更有利于細胞增殖。掃描電鏡和共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn):細胞在RNFS表面隨機分布，在ANFS表面沿著取向納米纖維方向定向拉伸并有序排列，在ANYNFS中，部分細胞沿著納米紗拉伸并有序排列，部分細胞隨機排列。組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，細胞可長入ANYNFS內(nèi)部。而在RNFS和ANFS中，細胞僅能在支架表面二維生長，無法長入支架內(nèi)部。
　　結論:本實驗構建的

10、新型三維SF/P(LLA-CL)取向納米紗/納米纖維復合支架比無規(guī)納米纖維支架和取向納米纖維支架有更大的孔徑和更高的孔隙率。該支架能夠促進細胞的增殖，引導細胞有序排列。該支架的力學強度在平行于納米紗方向得到了增強，有良好的力學性能和各向異性的力學特點，能夠模擬單層纖維環(huán)的細胞外基質(zhì)的結構并具有相似的力學性能。該支架具有良好的三維結構，有利于細胞長入支架內(nèi)部，達到三維培養(yǎng)細胞的效果。該支架在保證力學強度的同時提供了較高的孔隙率，非常適合纖