缺陷發(fā)光的納米-微米級(jí)羥基磷灰石對(duì)成骨細(xì)胞的細(xì)胞毒性、攝取及分化功能的影響.pdf

1、羥基磷灰石（HAP）是脊椎動(dòng)物骨骼和牙齒的主要成分。文獻(xiàn)報(bào)道 HAP的生物相容性與其形貌尺寸有關(guān)，適宜的 HAP能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞（OBs）的增殖及分化，HAP可廣泛應(yīng)用在骨組織材料領(lǐng)域。納米尺寸的HAP能夠跨膜進(jìn)入細(xì)胞，但是HAP如何進(jìn)入細(xì)胞以及在細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞分布尚不明確，HAP促進(jìn)OBs成骨分化的作用機(jī)制也有待進(jìn)一步探討。
　　本課題合成了缺陷發(fā)光的納米/微米級(jí) HAP，并對(duì)其進(jìn)行了理化性質(zhì)表征，生物相容性評(píng)價(jià)，攝取和亞細(xì)胞定

2、位，以及對(duì)OBs成骨分化的影響四個(gè)方面做了研究，主要內(nèi)容如下：
　　1、缺陷發(fā)光納米/微米HAP的合成及表征。本論文通過(guò)水熱法合成了三種不同形貌和尺寸的缺陷發(fā)光HAP納米/微米粒子：短棒（S1）和長(zhǎng)棒（S2）兩種納米材料，以及由棒狀HAP自組裝成的微米級(jí)刺球（S3）。通過(guò)XRD和FTIR證實(shí)三種材料均為HAP，熒光光譜表明它們的激發(fā)波長(zhǎng)在紫外區(qū)，發(fā)射波長(zhǎng)在藍(lán)紫光短波區(qū)。DLS和Zeta電位結(jié)果表明棒狀納米顆粒HAP（S1，S2）均

3、在杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)中產(chǎn)生團(tuán)聚，粒子團(tuán)聚后體系的穩(wěn)定性良好。缺陷發(fā)光HAP的合成過(guò)程中沒(méi)有摻雜其他發(fā)光基團(tuán)，與天然的HAP具有相同的化學(xué)成分。因此，研究該缺陷發(fā)光HAP的生物學(xué)效應(yīng)，更接近于天然HAP在骨組織中的生物學(xué)效應(yīng)。
　　2、缺陷發(fā)光HAP的生物相容性評(píng)價(jià)。分別從材料的耐蝕性、細(xì)胞毒性、致炎性、基因毒性和血液相容性五個(gè)方面考察了三種缺陷發(fā)光HAP的生物安全性。三種形貌的HAP無(wú)致炎性、具有較好的耐蝕性和血液相容性。

4、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示短棒S1和刺球S3抑制了OBs的活性，引起了OBs皺縮和細(xì)胞內(nèi)ROS升高；彗星實(shí)驗(yàn)證實(shí)短棒S1和刺球S3具有一定的基因毒性。長(zhǎng)棒S2在五個(gè)方面的測(cè)試中均沒(méi)有表現(xiàn)出毒性，具有優(yōu)良的生物相容性。
　　3、OBs攝取缺陷發(fā)光HAP的內(nèi)吞作用機(jī)制及亞細(xì)胞定位。已有文獻(xiàn)報(bào)道納米尺寸的HAP能進(jìn)入細(xì)胞，但是內(nèi)吞作用機(jī)制及亞細(xì)胞定位一直沒(méi)有明確的闡述。本論文通過(guò)使用不同的細(xì)胞內(nèi)吞抑制劑，發(fā)現(xiàn)HAP主要通過(guò)大胞飲和穴樣內(nèi)陷途徑

5、進(jìn)入OBs。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察發(fā)現(xiàn)，棒狀S1和S2納米粒子進(jìn)入OBs后，定位于溶酶體，并沒(méi)有進(jìn)入細(xì)胞核；刺球S3微米粒子沒(méi)能進(jìn)入OBs。
　　4、缺陷發(fā)光HAP對(duì)OBs成骨分化的影響。缺陷發(fā)光的HAP粒子抑制了成骨分化的早期指標(biāo)堿性磷酸酶（ALP）的活性，但是卻促進(jìn)了OBs膠原的分泌和礦化結(jié)節(jié)的生成量。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，HAP作用于細(xì)胞14天后，S2促進(jìn)細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因骨鈣素（OCN）的表達(dá)，S1和

6、S3對(duì)OCN的表達(dá)表現(xiàn)出抑制作用。通過(guò)熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，礦化結(jié)節(jié)的中心部位有藍(lán)色熒光，該熒光為缺陷發(fā)光HAP的光信號(hào)，表明HAP對(duì)礦化結(jié)節(jié)的形成具有一定的成核作用。
　　綜上，S1和S2通過(guò)大胞飲和穴樣內(nèi)陷途徑進(jìn)入OBs，S1引起細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高，進(jìn)而引起的DNA損傷（基因毒性）。S1和S2進(jìn)入細(xì)胞后定位于溶酶體，在溶酶體的酸性環(huán)境下溶解釋放出Ca2+，為細(xì)胞礦化提供了Ca2+源。細(xì)胞外的S1、S2、S3作為礦化核，同樣促進(jìn)