CaMKⅡα蛋白的異源表達(dá)及與納米材料相互作用的初步研究.pdf

1、納米材料進(jìn)入生物體后，會接觸上千種蛋白，引起多種生物學(xué)效應(yīng)甚至產(chǎn)生毒性，其原因主要是納米材料與體內(nèi)細(xì)胞、蛋白質(zhì)等相互作用。納米材料與蛋白質(zhì)結(jié)合后會對其構(gòu)型、活性和穩(wěn)定性等產(chǎn)生影響，進(jìn)而改變蛋白結(jié)構(gòu)和功能。富勒烯納米晶體具有獨(dú)特的三維共軛結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)，因此在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域中極具潛力，其應(yīng)用包括DNA的光剪切、酶抑制作用、腫瘤治療、藥物載體、抗菌和細(xì)胞保護(hù)等。
　　研究已表明富勒烯納米晶體（C60）具有與N-甲基D-天冬氨酸（

2、NMDA）受體NR2B亞基相似的功能，通過與鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱα（CaMKⅡα）發(fā)生特異、穩(wěn)定性相互作用，從而將其鎖定在活化狀態(tài)，引發(fā)特定信號傳遞，促進(jìn)學(xué)習(xí)與記憶過程。研究納米材料與蛋白質(zhì)相互作用，將有助于全面了解其作用機(jī)理，同時也為其開發(fā)新的醫(yī)學(xué)應(yīng)用及安全性設(shè)計(jì)提供了重要的理論依據(jù)。
　　本論文主要分為兩個部分：
　?。?）為了提高表達(dá)量，將CaMKⅡα蛋白在不同標(biāo)簽的載體中進(jìn)行融合表達(dá)，并對表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化

3、。結(jié)果表明在pET22b載體中，菌種按0.1％接種量，加入0.2 mM IPTG，在16℃條件下誘導(dǎo)16 h表達(dá)效果最好。隨后通過親和層析、分子篩等純化操作，以其獲得可溶性的目的蛋白，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供足夠樣品。
　?。?）通過溶劑置換法制備了C60水懸液，并用UV、DLS對其進(jìn)行了表征。利用Langmiur平衡吸附等溫模型考察了1μg C60可最大結(jié)合5.435μg CaMKⅡα蛋白。DLS結(jié)果顯示納米晶體吸附蛋白后以單體形式為主，

4、僅有少量的團(tuán)聚體。隨后在模擬生理?xiàng)l件下，利用光譜實(shí)驗(yàn)和分子模擬技術(shù)研究了不同溫度下C60與CaMKⅡα相互作用結(jié)合參數(shù)。結(jié)果如下：
　　根據(jù)熒光猝滅原理判斷猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅，并得出在298 K，310 K和318K三個不同溫度下的結(jié)合常數(shù)分別為4.87×105，6.47×105，7.65×105 L·mol-1。通過計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)，焓變ΔH為正值（209.805 kJ/mol），熵變ΔS為正值（778.364 J/mol/K）。

5、由此推斷 C60與CaMKⅡα結(jié)合是靠疏水作用進(jìn)行的自發(fā)反應(yīng)，與分子模擬結(jié)果一致。分子模擬研究進(jìn)一步表明，C60主要以π-π鍵形式和蛋白分子中芳香族或帶電殘基結(jié)合，是對熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)很好的補(bǔ)充。紫外光譜和同步熒光光譜結(jié)果說明C60可以引起蛋白疏水腔中Trp殘基周圍微環(huán)境的疏水性降低，極性增加。此外，根據(jù)圓二色譜的擬合數(shù)據(jù)，定量計(jì)算了蛋白分子二級結(jié)構(gòu)，表明C60對蛋白二級結(jié)構(gòu)沒有顯著的影響，僅使α-螺旋降低了1.8%，β-折疊升高了1.1%。