硫氧還蛋白還原酶表達(dá)上調(diào)治療非酒精性脂肪性肝病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)，是一組以肝細(xì)胞脂肪變性、壞死、炎性細(xì)胞浸潤等為主要特征的臨床病理綜合征，其肝臟組織學(xué)病變與酒精性肝病相類似，但無過量飲酒史。根據(jù)病理學(xué)改變分為單純性脂肪肝(NASFL)、脂肪性肝炎(NASH)、脂肪性肝纖維化并且可逐漸進(jìn)展為肝硬化、肝癌等終末期肝病，已成為目前僅次于慢性病毒性肝炎和酒精性肝病的重要肝硬化前期病變。NAFLD患者常

2、伴隨肥胖、脂代謝紊亂、高血壓和糖代謝異常等代謝綜合征(MS)的主要組分，因此被認(rèn)為是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)。流行病學(xué)顯示，NAFLD在世界各地均有發(fā)病，令人擔(dān)憂的是，隨著肥胖病的流行，兒童和青少年肥胖逐漸增加，甚至很大一部分病人既沒有肥胖也沒有糖尿病，表明NAFLD的患病率將顯著上升，嚴(yán)重危害人民健康，已成為一個(gè)重要的公共健康問題和社會(huì)問題，但至今尚未找到有效的治療手段。因此探討其發(fā)病機(jī)制，尋求有效治療具有十分積極的社會(huì)意義。

3、目的：非酒精性脂肪性肝病發(fā)病率不斷攀高且起病漸趨低齡化，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床上仍缺乏有效的治療手段。目前認(rèn)為脂肪代謝障礙使肝臟脂肪內(nèi)環(huán)境失衡是肝脂肪變性的基礎(chǔ)，而氧化應(yīng)激被認(rèn)為是肝臟脂肪變發(fā)展為脂肪性肝炎的催化劑。氧應(yīng)激使機(jī)體產(chǎn)生大量的反應(yīng)性氧化物(ROS)，當(dāng)其產(chǎn)生超過機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)的清除能力或細(xì)胞中保護(hù)體系的功能降低，就會(huì)造成大分子損傷和包括凋亡在內(nèi)的病理變化。體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的減少或缺乏使活性氧滅活障礙，而又加強(qiáng)了氧化應(yīng)激。氧

4、化/抗氧化失衡是造成NAFLD發(fā)生發(fā)展的重要原因。硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase，TrxR)是一種具有抗氧化作用的含硒酶，其活性與硒的含量密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道，肝炎、肝硬化患者的TrxR活性均低于正常人。TrxR對(duì)高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)療效的研究少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用高脂膽固醇飲食建立非酒精性脂肪肝大鼠模型，觀察大鼠肝組織中TrxR活性和基因的表達(dá)情況，對(duì)TrxR在NAFLD發(fā)病機(jī)理中的作用進(jìn)

5、行初步探討，同時(shí)觀察降脂益肝沖劑和亞硒酸鈉對(duì)肝組織TrxR活性和基因表達(dá)的影響，探討其可能的分子治療機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：1．動(dòng)物模型的建立及標(biāo)本的采集：60只雄性Wistar大鼠正常喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(N組)：給予正常飼料；模型對(duì)照組(M組)，用藥組(D組)，補(bǔ)硒組(X組)：給予高脂飼料(85％普通飼料，13％的豬油和2％的膽固醇)，N組和M組每組20只，D組和X組每組10只大鼠。實(shí)驗(yàn)設(shè)8、13周

6、兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)，N組和M組每個(gè)時(shí)點(diǎn)10只大鼠，相對(duì)應(yīng)的組別為N1、N2，M1、M2；于實(shí)驗(yàn)第8周末將N1組和M1組大鼠處死，以觀D組和X組每組10只大鼠。實(shí)驗(yàn)設(shè)8、13周兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)，N組和M組每個(gè)時(shí)點(diǎn)10只大鼠，相對(duì)應(yīng)的組別為N1、N2，M1、M2；于實(shí)驗(yàn)第8周末將N1組和M1組大鼠處死，以觀察造模情況，同時(shí)D組和X組則分別給予降脂益肝沖劑1ml/100g，以0.8g/ml的濃度和亞硒酸鈉1ml/100g，4μg/ml的濃度溶解灌胃，每日兩

7、次，N2組和M2組大鼠則分別給予等量的生活飲用水灌胃，每日兩次，共持續(xù)5W。實(shí)驗(yàn)第13周末處死剩余各組大鼠，自腹主動(dòng)脈采血，迅速取出肝臟，按常規(guī)制備血清、肝勻漿以及肝組織切片，并留取少量肝組織于-70℃低溫保存。 2．檢測(cè)指標(biāo)：測(cè)體重、體長、肝脾濕重，并計(jì)算肝指數(shù)(肝濕重/體重×100％)、Lee’s指數(shù)(體重0.33/體長×1000)及肝脾比值(肝濕重/脾濕重)等體質(zhì)指標(biāo)；全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)

8、氨酶(AST)、血脂及肝組織脂質(zhì)含量，葡萄糖氧化酶法測(cè)定空腹血糖(FBG)，銅染色法測(cè)定血清和肝組織游離脂肪酸(FFA)水平，放免法測(cè)定血清空腹胰島素(FINS)和腫瘤壞死因子(TNF—α)水平，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI=ln〔1/(FINS×FBG)〕)；黃嘌呤氧化酶法測(cè)定肝組織超氧化物歧化酶(SOD)活性；硫代巴比妥酸法測(cè)定肝組織丙二醛(MDA)含量；NADPH偶聯(lián)法測(cè)定肝組織谷光甘肽過氧化物酶(GSH—PX)活性，DTNB法測(cè)定

9、肝組織硫氧還蛋白還原酶(TrxR)活性；光鏡下評(píng)估脂肪變性和炎癥活動(dòng)情況；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)測(cè)定肝組織TrxRmRNA的表達(dá)。 結(jié)果：1．N組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索圍繞中央靜脈呈放射狀分布，細(xì)胞呈多邊形，大小較一致；各項(xiàng)生化指標(biāo)均在正常范圍；硫氧還蛋白還原酶mRNA表達(dá)較強(qiáng)。 2.8周末，與對(duì)照組N1組相比，模型組M1組大鼠出現(xiàn)了明顯的脂質(zhì)代謝紊亂，伴隨高胰島素血癥和胰島素抵抗；肝組織出現(xiàn)了輕到中度脂肪

10、變，且無炎細(xì)胞浸潤；血清轉(zhuǎn)氨酶水平較正常組明顯升高，TNF—α水平升高；肝組織總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、MDA升高，SOD、GSH—PX、TrxR活性降低；肝臟TrxR mRNA的表達(dá)較其對(duì)照組顯著降低。(P＜0.05)。 3.13周末，模型組M2組大鼠胰島素抵抗程度較M1組無明顯進(jìn)展；和正常組相比，肝組織出現(xiàn)中到重度脂肪變，肝小葉內(nèi)炎細(xì)胞浸潤和散在的點(diǎn)狀壞死，炎癥活動(dòng)度計(jì)分明顯高于正常組(P＜0.01)；M2組氧化

11、應(yīng)激程度較M1組進(jìn)展明顯；血脂和肝臟脂質(zhì)含量、血清TNF—α含量、轉(zhuǎn)氨酶水平明顯升高；HDL—C含量明顯降低；肝組織TC、TG、MDA升高，SOD、GSH—PX、TrxR活性降低；肝組織TrxR mRNA表達(dá)顯著降低，且與前期相比差異顯著(P＜0.01)。用藥組和補(bǔ)硒組大鼠血清和肝組織各項(xiàng)指標(biāo)均明顯改善；肝組織脂變程度及炎癥活動(dòng)度明顯減輕(P＜0.05，P＜0.01)；肝組織TrxRmRNA表達(dá)顯著增高。(P均＜0.01)。

12、結(jié)論：1．高脂高膽固醇飲食可以成功復(fù)制NAFLD大鼠模型；胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激以及炎癥因子如TNF—α紊亂與NAFLD的發(fā)生密切相關(guān)。 2．正常大鼠肝臟可表達(dá)硫氧還蛋白還原酶，NAFLD大鼠肝臟硫氧還蛋白還原酶基因表達(dá)下調(diào)，且隨造模時(shí)間延長表達(dá)量顯著降低；首次證明NAFLD動(dòng)物模型中TrxR mRNA表達(dá)下調(diào)。 3．降脂益肝沖劑對(duì)NAFLD具有良好的防治療效果(1)能顯著降低NAFLD大鼠血清和肝組織中T

13、C、TG、LDL—C、FFA含量，顯著升高HDL—C含量，改善高血脂、高肝脂狀態(tài)，從而很好地調(diào)整脂質(zhì)代謝，減少肝臟脂質(zhì)沉積減輕肝細(xì)胞脂肪變性。(2)能夠上調(diào)肝組織TrxR mRNA的表達(dá)。(3)能夠?qū)AFLD的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行干預(yù)，其部分作用的發(fā)揮可能與上調(diào)肝臟硫氧還蛋白還原酶mRNA的表達(dá)有關(guān)。 4.亞硒酸鈉可以有效地防治大鼠非酒精性脂肪性肝炎，可能與上調(diào)肝臟硫氧還蛋白還原酶mRNA的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝，對(duì)抗氧化應(yīng)激和