NKT細(xì)胞對不同嚴(yán)重程度支氣管哮喘的實驗研究.pdf

1、目的：建立不同嚴(yán)重程度支氣管哮喘的小鼠模型，并在此基礎(chǔ)上研究自然殺傷T細(xì)胞（Natural killer T cells，NKT）在不同嚴(yán)重程度支氣管哮喘小鼠的作用，初步揭示NKT在支氣管哮喘發(fā)病中的機(jī)制，進(jìn)而為探索支氣管哮喘治療的新方法奠定一定基礎(chǔ)。
　　方法：利用不同濃度卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）激發(fā)致敏小鼠，建立不同嚴(yán)重程度支氣管哮喘小鼠模型，并利用α-半乳糖神經(jīng)酰(α-galactosylceramide，α-

2、Galcer)激活NKT細(xì)胞對不同嚴(yán)重程度支氣管哮喘進(jìn)行干預(yù)。將雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組，即生理鹽水（Normal saline，NS）組，1％OVA組、1%OVA+α-Galcer組，5%OVA組，5%OVA+α-Galcer組。于0d、14d給予各處理組小鼠腹腔注射OVA溶液致敏，同時NS組注射NS溶液做對照。在第25天霧化激發(fā)前1小時，NS組、1%OVA組和5%OVA組中每只小鼠用移液槍鼻腔滴入 NS，1%OVA+α-Ga

3、lcer組和5%OVA+α-Galcer組中每只小鼠用移液槍鼻腔滴入α-Galcer。第25，26，27天霧化吸入OVA進(jìn)行激發(fā)，NS組予NS霧化，1%OVA組和1%OVA+α-Galcer組予1%OVA霧化，5%OVA組和5%OVA+α-Galcer組予5%OVA霧化，霧化期間觀察小鼠行為學(xué)改變。最后一次霧化24小時后，用Buxco小鼠肺功能儀有創(chuàng)肺阻抗法測定小鼠的氣道反應(yīng)性（Airway hyper reactivity，AHR）；

4、然后眼球取血，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清OVA特異性IgE；并進(jìn)行肺部灌洗，收集肺泡灌洗液（Bronchial lavage fluid，BALF），利用全自動細(xì)胞計數(shù)儀器記錄肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)。流式細(xì)胞術(shù)檢測BALF中各類細(xì)胞（包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞（Eosinophil，EOS））的比例。CBA法檢測小鼠BALF中細(xì)胞因子γ-干擾素（interferon，IFN-γ），白介素（Interle

5、ukin，IL）-4、-5和-13的水平。HE染色支氣管肺組織切片觀察氣道炎癥病理變化，根據(jù)血管、氣道周圍以及肺間質(zhì)炎性表現(xiàn)情況不同進(jìn)行評分(分值為0-3分)。
　　結(jié)果：1.不同嚴(yán)重程度支氣管哮喘模型建立： NS組小鼠在霧化15min后出現(xiàn)輕微煩躁；1%OVA組小鼠在霧化8min出現(xiàn)煩躁不安、呼吸加深加快、頻繁抓口鼻和四肢、弓背直立、前肢縮抬行為學(xué)改變；5%OVA組小鼠霧化5min后出現(xiàn)上述更為明顯癥狀。1%OVA組和5%OVA

6、組小鼠肺組織病理改變、BALF中細(xì)胞總數(shù)及EOS比例、BALF中IL-4,-5,13水平、血清OVA特異性IgE水平和氣道阻力較NS組明顯升高（P<0.05或P<0.01），且5%OVA組較1%OVA組升高更為明顯（P<0.05或P<0.01）。2.α-Galcer干預(yù)后不同嚴(yán)重程度支氣管哮喘小鼠的行為學(xué)觀察：NS組小鼠在霧化15min后出現(xiàn)輕微煩躁及抓耳撓腮的癥狀；1%OVA組在霧化8min出現(xiàn)煩躁不安、呼吸加深加快、頻繁抓口鼻和四肢

7、、弓背直立、前肢縮抬等癥狀；1%OVA＋α-Galcer組霧化10min后出現(xiàn)上述癥狀，程度減輕；5%OVA組在霧化5min后出現(xiàn)煩躁不安、呼吸加深加快、頻繁抓口鼻和四肢、弓背直立、前肢縮抬、點頭呼吸、大小便失禁等；5%OVA＋α-Galcer組的在霧化8min后出現(xiàn)上述癥狀，程度減輕。3.α-Galcer干預(yù)后不同嚴(yán)重程度支氣管哮喘小鼠的組織病理學(xué)表現(xiàn)：NS組小鼠支氣管、血管周圍及肺間質(zhì)炎性細(xì)胞無明顯浸潤；與NS組相比，1%OVA組炎

8、性細(xì)胞輕度浸潤，見少許EOS，支氣管管腔不規(guī)則，肺泡腔融合，差異明顯（P<0.05）；同1%OVA組相比，1%OVA+α-Galcer組有少許炎性細(xì)胞浸潤，幾乎無EOS浸潤，有顯著性差異（P＜0.01）；5%OVA組炎性細(xì)胞明顯浸潤，可見大量EOS，支氣管管腔不規(guī)則且狹窄明顯，周圍血管充血水腫，肺泡腔融合進(jìn)一步擴(kuò)大（P<0.01）；同5%OVA組相比，5%OVA+α-Galcer組彌漫炎性細(xì)胞浸潤，大量的EOS，支氣管管腔不規(guī)則且狹窄明

9、顯，肺泡腔融合，無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。4.α-Galcer干預(yù)后不同嚴(yán)重程度支氣管哮喘小鼠的BALF中細(xì)胞總數(shù)及EOS的改變：相對于NS組而言，不同濃度的OVA組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)均明顯升高，同時5%OVA組BALF中細(xì)胞總數(shù)升高最多。對于不同嚴(yán)重程度的支氣管哮喘小鼠，α-Galcer治療均能有效降低BALF中的細(xì)胞總數(shù)（P<0.05）。5%OVA組小鼠的BALF中EOS比例較NS組、1%OVA組升高(P<0.01)，但1%OVA組與N

10、S組無明顯差異（P＞0.05），α-Galcer治療能夠降低1%OVA激發(fā)組BALF中EOS的比例（P＜0.05），但在5%OVA激發(fā)組中沒有觀察到明顯效果。5.α-Galcer干預(yù)后不同嚴(yán)重程度支氣管哮喘小鼠BALF中細(xì)胞因子水平檢測：與NS組比較，不同濃度OVA激發(fā)能不同程度地升高小鼠BALF中IL-4，-5和-13的水平，同時降低BALF中IFN-γ的水平。α-Galcer治療能明顯降低1%OVA激發(fā)組模型小鼠BALF中IL-4和

11、IL-5的水平，升高IFN-γ的水平，但對5%OVA組小鼠作用較弱，無顯著性差異。6.α-Galcer干預(yù)后不同嚴(yán)重程度支氣管哮喘小鼠氣道反應(yīng)性檢測：當(dāng)組胺濃度為4mg/ml、8mg/ml時，1%OVA組和5%OVA組小鼠的氣道阻力較NS組明顯升高（P＜0.01），低劑量組胺刺激時，5%OVA組較1%OVA組小鼠的氣道反應(yīng)性明顯升高（P＜0.05），而在高濃度組胺刺激時，兩組間無明顯差異(P＞0.05)；用不同濃度組胺刺激時，α-Gal