肌肉生長(zhǎng)抑素對(duì)小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1增殖和分化的影響.pdf

1、目的:
　　 肥胖是目前人類(lèi)健康所面臨的最大挑戰(zhàn)之一，其核心病理生理過(guò)程是能量攝入與消耗之間的不平衡，導(dǎo)致過(guò)剩的能量以脂肪形式在體內(nèi)堆積。脂肪細(xì)胞數(shù)量增多和體積增大是機(jī)體脂肪組織增加的根本途徑，因而受到了研究者廣泛的關(guān)注。肌肉生長(zhǎng)抑素(myostatin，MSTN)因其對(duì)骨骼肌生長(zhǎng)的強(qiáng)烈負(fù)性調(diào)節(jié)作用于1997年被發(fā)現(xiàn)，此后又發(fā)現(xiàn)其與脂代謝亦存在密切關(guān)系:多項(xiàng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提示MSTN功能缺失具有抗脂肪形成的作用；體外細(xì)胞水平的研究則提

2、示，MSTN抑制前脂肪細(xì)胞的分化，使其脂質(zhì)累積減少，但對(duì)前脂肪細(xì)胞的增殖有無(wú)影響，對(duì)前脂肪細(xì)胞分化的可能的作用靶點(diǎn)是什么？目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。所以本研究旨在探討MSTN對(duì)小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1增殖及分化的影響，并尋找可能的作用靶點(diǎn)。
　　 方法:
　　 1.MSTN對(duì)小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1增殖的影響:
　　 以AIMV無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)3T3-L1細(xì)胞，使其自然增殖，于增殖第3天起以不同濃度(0～6.4

3、nM) MSTN作用于增殖中的3T3-L1細(xì)胞，之后每24小時(shí)以MTT法觀察細(xì)胞增殖情況；
　　 2.MSTN對(duì)小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1分化的影響:
　　 2.1.采用含胰島素、地塞米松與IBMX的分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化3T3-L1細(xì)胞，于誘導(dǎo)分化第8天起以不同濃度(0～20nM)MSTN作用于分化中的3T3-L1細(xì)胞，此后每3天以油紅O染色并染料提取的半定量方法及細(xì)胞內(nèi)甘油三酯測(cè)定的方法了解細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量，從而觀察MST

4、N對(duì)3T3-L1細(xì)胞分化的影響。
　　 2.2.3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化8天后加入不同濃度(0及20nM) MSTN，作用3天后收集細(xì)胞提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的方法對(duì)維持分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(PPARγ及CEBPα)、脂代謝關(guān)鍵酶(LPL、ACC1、ACS1、FAS、GPDH、DGAT、HSL、ATGL及CPT1)及脂肪因子(leptin、adiponectin、resistin、visfati

5、n及PAI-1)mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，尋找MSTN影響3T3-L1細(xì)胞分化的可能作用靶點(diǎn)。
　　 結(jié)果:
　　 1.MSTN對(duì)小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1增殖的影響:
　　 1.1.0.025nMMSTN抑制3T3-L1細(xì)胞的增殖，持續(xù)作用至24小時(shí)該作用達(dá)到峰值(OD值為對(duì)照組89.6±8.3％，p<0.01)，抑制作用隨持續(xù)作用時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱，至96小時(shí)該作用消失(OD值為對(duì)照組101.7±8.8％，p=

6、1.00)。
　　 1.2.0.2～6.4nM MSTN促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞的增殖，該作用具有劑量及時(shí)間依賴(lài)性，最大促進(jìn)作用可于3.2nM達(dá)到(96小時(shí)OD值為對(duì)照組187.0±14.7％，p<0.01)，進(jìn)一步提高M(jìn)STN濃度不能使其刺激增殖的效應(yīng)繼續(xù)放大(6.4nM MSTN在96小時(shí)OD值為對(duì)照組188.0±16.1％，p<0.01；但與3.2nM MSTN組相比，兩組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p=1.00)。
　　 2

7、.MSTN對(duì)小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1分化的影響:
　　 2.1.油紅O染色半定量法及甘油三脂測(cè)定法均提示MSTN對(duì)3T3-L1細(xì)胞的分化具有抑制作用，該抑制作用隨MSTN持續(xù)作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。至MSTN持續(xù)作用第6天，油紅O染色半定量法測(cè)定SnM MSTN組OD值為對(duì)照組59.8±11.6％，p<0.01:甘油三酯測(cè)定法5nM及10nM MSTN組甘油三酯含量分別為對(duì)照組90.6±4.9％及70.4±6.8％，p<0.01

8、。
　　 2.2.3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化8天，以10nM的MSTN作用3天后，與未加藥組相比，維持分化的轉(zhuǎn)錄因子PPARγ及CEBPa mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(分別為對(duì)照組60.2±5.8％，p<0.01及78.3±18.4％，p<0.05)；脂肪合成關(guān)鍵酶LPL、ACS1、GPDH及DGAT mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(分別為對(duì)照組52.4±9.4％、75.7±12.0％、56.9±2.4％及58.2γ11.6％ p<0

9、.01)，而ACC1及FASmRNA相對(duì)表達(dá)量輕度下降但結(jié)果不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為對(duì)照組93.8±15.6％ p＝0.589及92.2±16.0％p=0.449):脂肪分解關(guān)鍵酶HSL及ATGLmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(分為對(duì)照組75.8±7.4％及43.1±8.3％，p<0.01)而CPT1mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(為對(duì)照組117.2±9.7％，p<0.01)；脂肪因子leptin mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯變化(為對(duì)照組117.

10、2±9.7％，p<0.01)，adiponectin、resistin、visfatin mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(分別為對(duì)照組60.8±6.0％、29.6±1.6％及47.7±2.5％，p<0.01)而PAl-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(為對(duì)照組986.8±116.7％，p<0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.肌肉生長(zhǎng)抑素對(duì)小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1增殖的影響:肌肉生長(zhǎng)抑素在低濃度時(shí)輕度抑制3T3-L1細(xì)胞的