BRL37344對3T3-L1前體脂肪細胞分化的影響及機制研究.pdf

1、目的：
　　 肥胖與目前高發(fā)疾病如糖尿病和心血管疾病密切相關。目前觀點認為肥胖的原因不僅僅是脂肪組織的肥大，而且還有由前體脂肪干細胞分化為成熟脂肪細胞導致的脂肪組織增生。前體脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞是一個關鍵的過程，涉及特定基因和相關蛋白的協(xié)調(diào)表達。MEK/ERK信號通路是目前研究與脂肪細胞分化最為重要的信號通路之一。選擇性β3腎上腺素能受體激動劑(beta3-adrenergic receptor agonist，β3-AR

2、a)已被證明具有參與脂肪動員和產(chǎn)熱作用。BRL37344是一種選擇性β3腎上腺素能受體激動劑，在齲齒類動物相關研究中發(fā)現(xiàn)其具有促進脂肪分解和抗心律失常的作用，并且可以通過促進白色脂肪組織的脂肪分解及棕色脂肪組織的非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱來促進能量釋放，調(diào)控能量平衡，為抗肥胖藥物的研究提供了新的選擇角度。本研究旨在通過觀察研究選擇性β3腎上腺素能受體激動劑BRL37344對3T3-L1小鼠前體脂肪細胞分化的影響，進一步探討B(tài)RL37344在前脂肪細胞分

3、化中的作用機制。
　　 方法：
　　 本研究以3T3-L1小鼠前體脂肪細胞作為研究對象，分別應用BRL37344、MEK抑制劑PD98059、BRL37344+PD98059干預處理誘導分化的3T3-L1小鼠前脂肪細胞，以單獨應用標準生脂培養(yǎng)液誘導分化的前體脂肪細胞為對照組，另設標準生脂培養(yǎng)液+0.1％ DMSO作為DMSO對照組以排查0.1％ DMSO對前體脂肪細胞的毒性作用，48 h后換用含有上述新鮮配制干預藥物的維

4、持分化液，于誘導分化的第5d應用油紅O染色技術鑒定前體脂肪細胞分化程度，裂解細胞、收集蛋白-80℃凍存?zhèn)溆?。為了進一步探討B(tài)RL37344與胰島素對ERK1/2信號通路早期刺激作用的異同，待前體脂肪細胞完全匯合24 h，并剝奪血清4h，分別用Insulin、BRL37344、Insulin+BRL37344、BRL37344+PD98059處理細胞60 min，分別于藥物刺激的0 min、5 min、10 min、60 min裂解細胞、

5、收集蛋白。
　　 通過Western blot蛋白印跡法測定pERK、tERK及脂肪細胞特異性分化轉(zhuǎn)錄因子(peroxisome proliferator-activated receptorγ2，PPARγ2)表達水平的變化。每組實驗重復3次以上，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，應用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件分析，兩組均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.成

6、功誘導3T3-L1前體脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞。
　　 2.BRL37344能夠抑制前體脂肪細胞分化。
　　 3.3T3-L1前體脂肪細胞誘分化第5d，與對照組相比，BRL組及PD組PPARγ2表達明顯下調(diào)36.07％和45.08％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); DMSO組及PD+BRL組PPARγ2表達與對照組比較無明顯差異(P＞0.05）;與對照組比較BRL組pERK1/2呈強性表達，是正常對照組的2.99倍

7、(P＜0.05)，其余三組與對照組比較均無明顯差異（P＞0.05）;對于tER蛋白表達，與對照組相比均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05）。
　　 4.單獨應用胰島素處理前脂肪細胞60 min，pERK1/2表達迅速增加，高峰出現(xiàn)在第5 min，是作用0 min的1.60倍(P＜0.05);單獨的BRL37344也促使ERK磷酸化，并且磷酸水平持續(xù)至少60 min，分別是0 min的1.60倍(P＜0.05)、1.46倍、1.69倍(P

8、＜0.05);當用胰島素及BRL37344同時處理細胞時，pERK1/2高水平表達并且持續(xù)時間長達60 min，分別是0 min的1.71倍(P＜0.05)、1.33倍、1.59倍(P＜0.05);ERK1/2上游激酶MEK特異性抑制劑PD98059可以抑制BRL37344誘發(fā)的ERK磷酸化，作用高峰出現(xiàn)在第5 min，是0 min的2.12倍(P＜0.05)，隨后ERK的活化水平迅速下降。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功

9、建立3T3-L1前體脂肪細胞分化模型。
　　 2.BRL37344可以抑制3T3-L1前體脂肪細胞的分化。
　　 3.BRL37344可顯著增強ERK1/2的活化效應，下調(diào)3T3-L1前脂肪細胞分化過程關鍵因子PPARγ2表達水平，這可能是其抑制前脂肪細胞分化及抗肥胖的作用機制。
　　 4.PD98059能夠特異性阻斷ERK1/2激酶MEK對ERK1/2的磷酸活化，部分改善BRL37344對PPARγ2表達的下調(diào)