亞麻木酚素的提取純化與生物活性研究.pdf

1、亞麻籽中含有多種木酚索，其中開環(huán)異落葉松樹脂酚(SECO)的含量最高，SECO以二糖苷開環(huán)異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷(SDG)的形式存在于亞麻籽中。研究發(fā)現(xiàn)亞麻木酚素具有多種生物活性，如抗癌、防治心血管疾病、減緩更年期癥狀、預(yù)防骨質(zhì)疏松等。開發(fā)利用亞麻木酚素對(duì)預(yù)防這些膳食模式依賴性的疾病和提高人民身體素質(zhì)具有重要意義。亞麻小酚素的開發(fā)利用還可以大大提高亞麻籽的附加值，產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)國內(nèi)亞麻資源深加工與利用。 本文通過對(duì)亞

2、麻木酚素的測(cè)定、提取、純化及亞麻籽綜合利用方法的系統(tǒng)研究，建立了一條SDG提取和純化的工藝路線，具有安全、經(jīng)濟(jì)、易于工業(yè)化的優(yōu)點(diǎn)，得劍了高純度(95％以上)的木酚素產(chǎn)品。本文從體外細(xì)胞培養(yǎng)和化學(xué)計(jì)算相結(jié)合的角度出發(fā)，研究了亞麻木酚素的抗乳腺癌功效及其作用機(jī)理。通過生物活性實(shí)驗(yàn)與理論計(jì)算交互驗(yàn)證的方法解釋了其量效、構(gòu)效關(guān)系。 研究發(fā)現(xiàn)，在SDG的測(cè)定過程中，將堿水解與有機(jī)溶劑提取合并可以更充分地從脫脂亞麻籽殼中提取SDG。研究了木

3、酚素測(cè)定中普遍采用的酸水解方法對(duì)SDG的影響，純化的SDG樣品經(jīng)過酸水解主要生成3種產(chǎn)物，低鹽酸濃度下產(chǎn)物以SECO及開環(huán)異落葉松樹脂酚葡糖苷(SG)為主，提高鹽酸濃度和作用時(shí)間，產(chǎn)物以脫水開環(huán)異落葉松樹脂酚(ANHSEC)為主，但木酚素總量降低。采用HPLC-PAD-MS可準(zhǔn)確測(cè)定SDG、SG、SECO與ANHSEC，采用NMR驗(yàn)證了HPLC-PAD-MS的測(cè)定結(jié)果并鑒別了SDG的構(gòu)型。以SDG為對(duì)照，建立了HPLC定最方法，避免了酸

4、水解導(dǎo)致的損失，路線簡便，方法可靠，靈敏度令人滿意。本文還采用比色法測(cè)定SDG，使其定量更為方便快捷。 為富集SDG和綜合利用亞麻籽中功能性成分，本文采用濕法脫粘，以粘性脫除率(定義為粘質(zhì)物脫除率與0.1％粘質(zhì)物溶液粘度的乘積)為指標(biāo)，確定了最適脫粘條件：溫度70℃，水料比7:1，DH 6.0，時(shí)間60 min，脫粘4次。分析了所得粗亞麻籽膠的組成，其多糖與蛋白含量分別為65.4％和8.50％(w/w)。其單糖組成(摩爾比例)為

5、鼠李糖：巖藻糖：阿拉伯糖：木糖：葡萄糖：半乳糖=5.10:1.00:4.18:8.98:2.13:2.75，木糖含量最高，表明中性多糖含量較高。采用濕法脫殼，在砂輪間距0.40 mm、砂輪轉(zhuǎn)速2800 rpm、水力分級(jí)兩次條件下，富仁、富殼與混合部分的得率分別為52.6％、22.3％和12.7％，總回收率87.7％，仁中含殼率和殼中含仁率分別為20.9％和11.1％，達(dá)到較為滿意的程度。分析了亞麻籽脫粘和仁殼分離的影響，發(fā)現(xiàn)部分SDG(

6、9.6％)隨粉碎的殼層流火，SDG主要分布在富殼部分，其次是混合部分，富仁部分含量很少。 采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法優(yōu)化了SDG的攪拌提取條什：提取溶劑為50％乙醇(v/v)，溫度60℃，液同比20 mL/g，時(shí)間3 h。該條件下SDG的得率達(dá)1.80g/100 g脫脂亞麻籽殼粉(DFHF)，向提取液中加入0.25 mol/L NaOH時(shí)，SDG的得率提高至1.90 g/100 g DFHF。研究了超聲輔助提取對(duì)亞麻木酚素得率的影響

7、，發(fā)現(xiàn)超聲功率160 W、時(shí)間30 min、溫度40℃的條件下，SDG得率可達(dá)到2.01 g/100 g DFHF。采用中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析確定微波輔助提取的工藝條什為：乙醇濃度40.9％(v/v)，液固比21.9:1(mL/g)，超盧處理5 min進(jìn)行預(yù)浸，在130 w微波功率下輻照90.5 s。該條件下SDG得率為2.19 g/100 g DFHF，高于常規(guī)攪拌提取和超盧輔助提取的得率。圓二色性檢測(cè)表明實(shí)驗(yàn)所用微波輻照條件對(duì)SD

8、G構(gòu)刑沒有影響。MAE大大縮短了提取時(shí)間，顯著提高了SDG的得率，并節(jié)省了能耗。 研究了亞麻水酚素粗提物在止己烷、氯仿、乙酸乙酯和水四種溶劑中的分配特性，發(fā)現(xiàn)SDG極性較大，主要保留在水相中。以洗脫物紫外吸收特征為評(píng)判指標(biāo)，采用硅膠柱層析法二次洗脫分離出SDG產(chǎn)物。HPLC-PAD-MS檢測(cè)其純度為91.85％，硅膠柱層析的同收率為92.4％。采用大孔吸附樹脂對(duì)SDG粗提物進(jìn)行了靜態(tài)吸附和解析。篩選出吸附率和解析率分別為86.4

9、％和95.1％的X-5大孔吸附樹脂。采用X-5為分離介質(zhì)，研究其動(dòng)態(tài)吸附特征及合適的洗脫條件，確定采用乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫分離SDG，在20％乙醇洗脫組分中檢測(cè)出SDG，其純度為65.7％，但整個(gè)分離過程同收率偏低，為80.8％。采用Sephadex LH-20凝膠柱分離純化SDG，確定水作為洗脫溶劑，二次分離得劍純度96.6％的SDG產(chǎn)物，同收率達(dá)到97.2％。 研究了不同濃度SECO及其在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物END與ENL對(duì)雌激

10、素剛性乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的抑制作用，并同金雀異黃素(GEN)進(jìn)行對(duì)照，發(fā)現(xiàn)SECO與GEN在較高濃度(分別為100和40 μmol/L)下對(duì)MCF-7具有抑制作用，而在低濃度(10～40和10～20μmol/L)下促進(jìn)MCF-7增殖作用。END和ENL在10～100μmol/L濃度下均表現(xiàn)出對(duì)MCF-7增殖的抑制作用。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了由100μmol/L 的SECO、40μmol/L的END、ENL與GEN作用斤的MCF-7細(xì)

11、胞的周期分布變化，發(fā)現(xiàn)G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例降低，G2/M期細(xì)胞比例略有增高，說明SECO、END、ENL與GEN可能是通過影響細(xì)胞DNA的增殖來實(shí)現(xiàn)對(duì)MCF-7的抑制作用的。 采用放射性配基競爭結(jié)合法測(cè)定了SECO與α雌激素受體(ER α)的結(jié)合活力，發(fā)現(xiàn)在10μmol/L濃度下SECO不具有與ERα結(jié)合的活力。采用分子對(duì)接方法(DOCK)研究了SECO、END、ENL等配基與雌激素受體對(duì)接過程中的能量變化(A

12、G)，結(jié)果表明△G與配基分子的結(jié)合活力間無明顯的線性相關(guān)性，通過對(duì)接研究初步確定了ERα與ERβ的配基結(jié)合部位及可能的作用方式。通過比較分子場(chǎng)分析(CoMFA)，建立了預(yù)測(cè)配基分子與ERα、ERβ結(jié)合活力的CoMFA模型，結(jié)果表明氫鍵在模型中起重要作用，模型的預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)測(cè)結(jié)果接近。采用該模型預(yù)測(cè)了END、ENL及SECO同ERβ與ERα的相對(duì)結(jié)合活力，結(jié)果表明ENL的結(jié)合活力遠(yuǎn)高于SECO，并且三者與ERβ的結(jié)合活力均高于與ERβ的結(jié)