雌激素增強(qiáng)大鼠脊髓背角淺層神經(jīng)元的突觸可塑性：非基因組機(jī)制.pdf

1、隨著女性社會地位的提高，疼痛的性別差異也日益受到重視。雌激素是一類重要的女性激素，屬類固醇類激素。天然雌激素有雌二醇、雌三醇及雌酮，17β-雌二醇(estradiol, E2)是女性體內(nèi)最強(qiáng)的天然雌激素。
　　大量研究表明，雌激素(estrogen)可作用于神經(jīng)系統(tǒng)而影響疼痛的程度，但雌激素發(fā)揮促痛作用還是抗痛作用尚沒有明確的定論，所涉及的機(jī)制也并不完全明確。考慮到目前多種疼痛更多的困擾著女性，使尋找和發(fā)現(xiàn)治療的新靶點(diǎn)變得更為迫切

2、。
　　關(guān)于雌激素對疼痛的調(diào)節(jié)在過去幾十年內(nèi)大部分都集中在核雌激素受體(nucleus estrogen receptor, nER)介導(dǎo)的基因組作用，即慢性作用。關(guān)于它對疼痛的非基因組作用即快速作用的研究甚少。那么，雌激素是否參與疼痛的快速調(diào)節(jié)呢？如果參與，調(diào)節(jié)機(jī)制是什么呢？
　　既往研究表明，雌激素對海馬等腦區(qū)的興奮性突觸傳遞和長時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)有快速調(diào)節(jié)作用，對海馬LTP

3、相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶也有影響。那么E2是否也可以快速調(diào)節(jié)痛覺通路上的興奮性突觸傳遞和脊髓LTP呢？如果發(fā)揮快速調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制又是什么呢？本研究圍繞這一系列問題，采用離體脊髓切片全細(xì)胞膜片鉗記錄和場電位記錄、行為學(xué)、免疫組織化學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法，初步探討了E2對疼痛的快速調(diào)節(jié)作用、E2對脊髓背角(spinal cord dorsal horn，SCDH)興奮性突觸傳遞和LTP的影響及其可能的細(xì)胞分子機(jī)制。主要結(jié)果如下:
　　1.內(nèi)源性和外源性

4、雌激素參與疼痛的急性調(diào)節(jié)
　　鞘內(nèi)給予E2(≤30min)可引起機(jī)械性觸誘發(fā)痛和熱痛覺過敏，此作用可被雌激素受體的拮抗劑ICI182，780阻斷，被膜雌激素受體(membrane estrogenreceptor, mER)的激動劑E2-BSA所模擬。給予ER(estrogen receptor, ER)的拮抗劑可抑制足底注射福爾馬林引起的晚時(shí)相痛行為。以上表明，外源性和內(nèi)源性雌激素參與對疼痛的急性調(diào)節(jié)。mER可能參與了E2的急性

5、致痛作用。
　　2.雌激素受體的亞細(xì)胞分布
　　免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果顯示:ERα/β與神經(jīng)元的標(biāo)記物NeuN、神經(jīng)元骨架的標(biāo)記物MAP2、谷氨酸能神經(jīng)元的標(biāo)記物Glutamate(Glu)有很好的共標(biāo)，GPR30與MAP2和Glu也有較好共標(biāo)，提示三種雌激素受體在谷氨酸能的神經(jīng)元上均有表達(dá);另外，活細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:結(jié)合有FITC的不透膜雌激素E2-BSA可特異性的結(jié)合膜上的受體，顯示空心狀的點(diǎn)狀著色，提

6、示膜上有mER的分布，這種點(diǎn)狀著色與NR1和GluR1有較好共存。
　　3.雌激素快速增強(qiáng)NMDA電流和NMDA-eEPSC
　　運(yùn)用脊髓背角全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，急性灌流E2(5-10 min)可濃度依賴性的增強(qiáng)脊髓背角淺層神經(jīng)元上外源性NMDA(N-methyl-D-aspartic acid)引起的電流，而對AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid)

7、電流的影響在各個(gè)細(xì)胞并不一致，總的呈現(xiàn)不變;胞內(nèi)給予G蛋白抑制劑GDP-β-S可阻斷E2對NMDA電流的增強(qiáng)作用，提示雌激素可通過GPCR(G protein coupledreceptor)快速增強(qiáng)突觸后NMDAR的功能。
　　進(jìn)一步，我們在電刺激背根刺激誘發(fā)的eEPSC觀察了E2對NMDA介導(dǎo)的成分(NMDA-eEPSCs)和AMPA介導(dǎo)的成分(AMPA-eEPSCs)的影響。E2灌流5-10 min可明顯增大NMDA-eEP

8、SCs/AMPA-eEPSCs的比值，該效應(yīng)主要與E2增大NMDA-eEPSCs成分相關(guān);急性灌流E2可快速(5-10 min)增強(qiáng)NMDA-eEPSCs，且至少可持續(xù)到E2洗脫后30分鐘，即E2可誘導(dǎo)出NMDA-eEPSCs的化學(xué)性LTP(chemical LTP, c-LTP);相反，E2對AMPA-eEPSCs有輕微減小作用;E2誘導(dǎo)的c-LTP可被ERβ的激動劑DPN模擬，而不能被ERα的激動劑PPT模擬，提示雌激素可能通過激活

9、ERβ增強(qiáng)MDAR介導(dǎo)的突觸傳遞。
　　4.雌激素增加突觸前遞質(zhì)釋放概率
　　急性灌流E2(5-10 min)可快速減小eEPSC的配對脈沖比值(paired pulse ratio PPR)，而對mEPSC/sEPSC的頻率和幅度無影響;提示E2可增加突觸前遞質(zhì)釋放概率。
　　5.雌激素通過調(diào)節(jié)NMDA受體NR2B易化初級傳入誘導(dǎo)的脊髓背角LTP
　　高頻刺激(high frequency stimutilat

10、ion，HFS)初級傳入進(jìn)入脊髓的李騷氏束(Lissauer's tract, LT)可穩(wěn)定誘導(dǎo)出脊髓背角淺層fEPSP的LTP(HF S-LTP)。E2預(yù)孵育40-60 min不僅可降低LTP的誘導(dǎo)閾值，還可以增強(qiáng)HFS-LTP的幅度，此作用可被ER的拮抗劑阻斷且可被mER的激動劑E2-BSA部分模擬。提示E2對LTP的易化作用有mER的參與。
　　通過藥理學(xué)分離的方法，在LT給予電刺激可在脊髓背角淺層記錄到NMDA-eEPSC

11、。給予E2預(yù)孵育40-60分鐘后給予HFS，與溶劑組對比;E2組明顯增強(qiáng)，提示E2可能是通過增強(qiáng)NMDAR的功能而增強(qiáng)HFS-LTP的。另外，NR2B的拮抗劑Ro25-6981可阻斷E2對LTP的易化作用，提示含NR2B的NMDAR功能的增強(qiáng)參與了E2對LTP的易化作用。
　　脊髓背角原代神經(jīng)元培養(yǎng)結(jié)合Western blot的結(jié)果顯示:急性給予E210min即可增加pNR2B，且可以增加膜上的NR2B的水平。提示，E2不僅可以通

12、過對NR2B的功能性調(diào)節(jié)還可通過上調(diào)膜上NR2B的數(shù)量從而增強(qiáng)NMDA突觸傳遞和脊髓LTP。
　　6.PKA/ERK信號通路可能參與了E2對脊髓背角HFS-LTP的增強(qiáng)作用
　　在培養(yǎng)的脊髓背角神經(jīng)元上給予E210min即可增加pPKA的表達(dá);免疫組織化學(xué)結(jié)合脊髓切片急性藥物孵育的方法發(fā)現(xiàn)，雌激素孵育10 min即可使活化的脊髓背角淺層pERK陽性神經(jīng)元的數(shù)量達(dá)到高峰;另外，雌激素激活的pERK與pPKA有較好共存;在體鞘內(nèi)

13、給予E2也可快速增加脊髓背角pERK的表達(dá)，10 min達(dá)到高峰，30min基本恢復(fù)到正常水平，E2對pERK的激活作用可被mER的激動劑E2-BSA所模擬;電生理學(xué)結(jié)果顯示，PKA的拮抗劑H89或ERK的阻斷劑PD98059不僅可阻斷E2對HFS-LTP的易化作用，還可完全阻斷脊髓LTP,說明PKA和ERK對脊髓LTP的形成是必需的。以上提示E2對脊髓LTP的增強(qiáng)可能通過PKA/ERK信號通路介導(dǎo)。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)