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文檔簡介
1、本文從以下幾個部分進(jìn)行探討。
第一部分 E13.5大鼠胚胎腎臟體外發(fā)育模型的建立
目的:分離E13.5大鼠胚胎后腎(Metanephric kidneys),采用二維培養(yǎng)法體外培養(yǎng)并進(jìn)行鑒定,建立大鼠胚胎腎臟體外發(fā)育模型。
方法:選取性成熟SD雄性大鼠與雌性大鼠數(shù)只進(jìn)行配種,獲得E13.5天孕鼠。用戊巴比妥麻醉并脫頸處死孕鼠,75%酒精浸泡消毒,在無菌條件下解剖獲得E13.5胚胎腎臟。培養(yǎng)時,將胚腎轉(zhuǎn)移至T
2、ranswell filter半透膜上,在6孔板中加入1ml DMEM/F-12培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和1%雙抗),于二氧化碳培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中連續(xù)培養(yǎng)3-5天。用倒置解剖顯微鏡拍照記錄發(fā)育情況。用免疫熒光染色法對培養(yǎng)5天的胚腎進(jìn)行標(biāo)志物染色并采用激光共聚焦顯微鏡拍照觀察。對培養(yǎng)5天的胚腎進(jìn)行石蠟包埋、切片以及HE染色,觀察胚腎發(fā)育的結(jié)構(gòu)變化。
結(jié)果:1.E13.5胚腎貼Transwell filter半透膜生長
3、,組織面積逐漸增大,輸尿管芽分枝逐漸增多,后腎間充質(zhì)逐漸發(fā)生分化;2.免疫熒光染色結(jié)果顯示,胚腎輸尿管芽(E-cadherin標(biāo)記)分枝隨著時間的增加逐漸增多,培養(yǎng)5天后輸尿管芽成樹枝狀展開,周圍分布著正在形成中的腎小球(Wt-1標(biāo)記);3.HE染色顯示培養(yǎng)5d后胚腎中出現(xiàn)大量正在形成的腎小管、腎小球以及集合管樣結(jié)構(gòu)。
結(jié)論:體外二維培養(yǎng)法能夠連續(xù)培養(yǎng)E13.5大鼠胚腎至少5天,胚腎具有輸尿管芽分枝和腎小球結(jié)構(gòu),表明發(fā)育模型基
4、本構(gòu)建成功,滿足體外實驗研究的要求。
第二部分 低氧微環(huán)境對大鼠胚腎體外發(fā)育表型的影響
目的:觀察不同氧分壓低氧微環(huán)境下大鼠胚腎發(fā)育表型的改變。
方法:體外分離E13.5大鼠胚胎腎臟,將同一窩胚腎進(jìn)行隨機分為實驗組和對照組,每組各8-10個腎臟。實驗組通過向培養(yǎng)箱中注入氮氣(N2)制造不同氧分壓(1%-5%O2)的低氧條件,模擬發(fā)育時期宮內(nèi)生理性低氧微環(huán)境,對照組胚腎則于常規(guī)氧分壓(21%O2)條件下培養(yǎng)。
5、運用免疫熒光染色技術(shù)對腎臟發(fā)育進(jìn)行染色標(biāo)記(E-cadherin標(biāo)記輸尿管芽,Wt-1標(biāo)記發(fā)育中的腎小球),運用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍照記錄。統(tǒng)計并比較兩組胚腎發(fā)育形態(tài)上的差異。
結(jié)果:1.極度低氧(1%O2)條件下輸尿管芽分枝和腎小球發(fā)育幾乎停滯,胚腎發(fā)育受到顯著抑制。2.適度低氧(3%O2以及5%O2)條件下體外連續(xù)培養(yǎng)3d,胚腎發(fā)育均受顯著抑制,表現(xiàn)為實驗組輸尿管芽分枝和發(fā)育中的腎小球數(shù)量較對照組顯著減少(P<0.05)
6、。3.適度低氧(5%O2)條件下延長培養(yǎng)時間至5d,與對照組相比輸尿管芽分枝數(shù)和發(fā)育中的腎小球數(shù)目仍顯著減少(P<0.05)。
結(jié)論:1%-5%O2低氧環(huán)境能夠顯著抑制體外培養(yǎng)的大鼠胚腎的發(fā)育,減少輸尿管芽分枝和腎小球形成數(shù)目。
第三部分 低氧微環(huán)境影響大鼠胚腎發(fā)育的機制研究
目的:探索低氧微環(huán)境影響體外培養(yǎng)的大鼠胚腎發(fā)育的可能機制。
方法:體外分離E13.5大鼠胚腎,將同一窩胚腎隨機分為實驗組和
7、對照組,每組各8-10個腎臟。實驗組選取5%O2作為低氧條件模擬宮內(nèi)低氧微環(huán)境,將胚腎置于5%O2低氧環(huán)境培養(yǎng),對照組胚腎置于21%O2常氧環(huán)境培養(yǎng)。運用免疫熒光染色技術(shù)標(biāo)記胚腎輸尿管芽分枝(anti-E-cadherin)、腎小球(anti-Wt-1)發(fā)育以及后腎間充質(zhì)多能干細(xì)胞(anti-Six2)。運用EdU(胸腺嘧啶核苷類似物)摻入法檢測培養(yǎng)3天后兩組胚腎細(xì)胞增殖情況,運用TUNEL(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶)法檢測培養(yǎng)3天后兩組胚
8、腎細(xì)胞凋亡情況。采用實時定量熒光PCR儀檢測相關(guān)基因相對的表達(dá)RQ值(RQ值=2-△△CT),并進(jìn)行統(tǒng)計分析。所用照片均采用AZ100宏觀激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍攝,運用美國NCBI公司Image J軟件進(jìn)行熒光半定量分析,統(tǒng)計并比較實驗組和對照組差異。
結(jié)果:1.與常氧組胚腎相比,低氧組大鼠胚腎細(xì)胞增殖受到顯著抑制,但細(xì)胞凋亡顯著減輕(均P<0.05)。2.低氧組大鼠胚腎后腎間充質(zhì)多能干細(xì)胞標(biāo)志分子Six2表達(dá)較常氧組顯著增多
9、(P<0.05)。3.與常氧組相比,低氧組大鼠胚腎基因表達(dá)發(fā)生顯著變化,其中代表著后腎間充質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)分化的關(guān)鍵調(diào)控因子Wnt9b和Wnt4表達(dá)顯著減少,代表足細(xì)胞和腎小管終末細(xì)胞的標(biāo)志分子Nsph2和Aqp1表達(dá)顯著減少(均P<0.05);后腎間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行自我更新的關(guān)鍵調(diào)控因子Six2和維持其生存的關(guān)鍵因子Wt-1及Pax2表達(dá)均顯著增多(P<0.05)。
結(jié)論:低氧顯著抑制體外培養(yǎng)條件下大鼠胚腎細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡,下調(diào)后
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