ABCA1基因對哺乳動物細胞抗砷性影響的研究.pdf

1、目的：本課題運用分子生物學方法,研究ABCA1基因表達增高和降低后哺乳動物細胞株抗砷性的變化,同時觀察細胞內砷含量的變化,從而確定ABCA1基因的抗砷功能,并推測其可能的抗砷機制。 方法：在Lipofectamine 2000轉染劑的介導下,將含有ABCA1基因的真核表達載體轉染入HeLa細胞,實時熒光定量PCR(real-time PCR)方法檢測轉染后目的基因mRNA水平：用蛋白質免疫印記法(Western-blot)檢測轉

2、染后ABCA1蛋白水平的改變,從而確定轉染效率,通過噻唑蘭法(MTT)檢測48h急性砷染毒后光密度值(OD)值計算生存率及半數抑制濃度(IC50),分析細胞抗砷性的變化,然后運用原子熒光分光光度法(AFS)檢測細胞內砷蓄積量的變化。同時,利用RNA干擾技術將ABCA1的小分子干擾RNA(siRNA)轉染入抗砷細胞ECV-304中,Western-blot檢測干擾后ABCA1蛋白水平的改變,確定干擾效率,然后通過噻唑蘭法檢測48h急性砷染

3、毒后OD值計算生存率及IC50,分析細胞抗砷性的變化。 結果：轉染48h后的real-time PCR結果顯示所有標本的管家基因GAPDH和ABCA1均可見較標準的擴增曲線,無非特異擴增。各組ABCA1及GAPDH Ct值比較結果顯示,轉染重組質粒pcDNA3.1/ABCA1在HeLa胞中ABCA1的表達量是轉染空質粒pcDNA3.1/V5-His組的22.6倍,轉染空質粒pcDNA3.1/V5-His組與未轉染的HeLa細胞A

4、BCA1表達量無明顯差異；Western-blot結果顯示重組質粒組、空質粒組及未轉染組在254 KD處均有特異性蛋白條帶,其大小與ABCA1蛋白大小相符,且重組質粒組蛋白表達量明顯高于轉染空載體組及未轉染組。這說明pcDNA3.1/ABCA1重組質粒已轉入HeLa細胞并使ABCA1蛋白在HeLa細胞中呈高表達狀態(tài)。轉染后急性砷染毒48h用噻唑蘭法計算生存率及IC50,結果顯示實驗組細胞在各種砷濃度下生存率均高于同步對照組細胞,兩組生存

5、率差異有統(tǒng)計學意義。實驗組IC50為36.740μmol/l高于對照組IC50為20.721μmol/l。原子熒光分光光度法結果顯示,ABCA1蛋白高表達后,HeLa細胞內砷含量在各時間段均低于對照組細胞,且4小時候后細胞內砷蓄積量趨于穩(wěn)定,而對照組細胞內砷蓄積量持續(xù)增加?？股榧毎鸈CV-304經siRNA干擾后,實驗組ABCA1蛋白表達量明顯低于陰性對照組,呈低表達狀態(tài),干擾后急性砷染毒48h,結果顯示實驗組細胞在各種砷濃度下生存率均