ABCA1基因?qū)Σ溉閯?dòng)物細(xì)胞抗砷性影響的研究.pdf

1、目的：本課題運(yùn)用分子生物學(xué)方法,研究ABCA1基因表達(dá)增高和降低后哺乳動(dòng)物細(xì)胞株抗砷性的變化,同時(shí)觀察細(xì)胞內(nèi)砷含量的變化,從而確定ABCA1基因的抗砷功能,并推測(cè)其可能的抗砷機(jī)制。 方法：在Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染劑的介導(dǎo)下,將含有ABCA1基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后目的基因mRNA水平：用蛋白質(zhì)免疫印記法(Western-blot)檢測(cè)轉(zhuǎn)

2、染后ABCA1蛋白水平的改變,從而確定轉(zhuǎn)染效率,通過(guò)噻唑蘭法(MTT)檢測(cè)48h急性砷染毒后光密度值(OD)值計(jì)算生存率及半數(shù)抑制濃度(IC50),分析細(xì)胞抗砷性的變化,然后運(yùn)用原子熒光分光光度法(AFS)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)砷蓄積量的變化。同時(shí),利用RNA干擾技術(shù)將ABCA1的小分子干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染入抗砷細(xì)胞ECV-304中,Western-blot檢測(cè)干擾后ABCA1蛋白水平的改變,確定干擾效率,然后通過(guò)噻唑蘭法檢測(cè)48h急性砷染

3、毒后OD值計(jì)算生存率及IC50,分析細(xì)胞抗砷性的變化。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染48h后的real-time PCR結(jié)果顯示所有標(biāo)本的管家基因GAPDH和ABCA1均可見(jiàn)較標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增曲線,無(wú)非特異擴(kuò)增。各組ABCA1及GAPDH Ct值比較結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1/ABCA1在HeLa胞中ABCA1的表達(dá)量是轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1/V5-His組的22.6倍,轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1/V5-His組與未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞A

4、BCA1表達(dá)量無(wú)明顯差異；Western-blot結(jié)果顯示重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組及未轉(zhuǎn)染組在254 KD處均有特異性蛋白條帶,其大小與ABCA1蛋白大小相符,且重組質(zhì)粒組蛋白表達(dá)量明顯高于轉(zhuǎn)染空載體組及未轉(zhuǎn)染組。這說(shuō)明pcDNA3.1/ABCA1重組質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入HeLa細(xì)胞并使ABCA1蛋白在HeLa細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)。轉(zhuǎn)染后急性砷染毒48h用噻唑蘭法計(jì)算生存率及IC50,結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在各種砷濃度下生存率均高于同步對(duì)照組細(xì)胞,兩組生存

5、率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組IC50為36.740μmol/l高于對(duì)照組IC50為20.721μmol/l。原子熒光分光光度法結(jié)果顯示,ABCA1蛋白高表達(dá)后,HeLa細(xì)胞內(nèi)砷含量在各時(shí)間段均低于對(duì)照組細(xì)胞,且4小時(shí)候后細(xì)胞內(nèi)砷蓄積量趨于穩(wěn)定,而對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)砷蓄積量持續(xù)增加?？股榧?xì)胞ECV-304經(jīng)siRNA干擾后,實(shí)驗(yàn)組ABCA1蛋白表達(dá)量明顯低于陰性對(duì)照組,呈低表達(dá)狀態(tài),干擾后急性砷染毒48h,結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在各種砷濃度下生存率均