Notch信號途徑在哺乳動物卵泡發(fā)育中作用的初步研究.pdf

1、Notch信號途徑是一條在進化上高度保守的通路，廣泛存在于多種生物體內(nèi)，主要調(diào)控細胞的增殖與分化。目前，關(guān)于Notch信號通路在卵巢中的作用主要是在果蠅中的研究，對于它在哺乳動物卵泡發(fā)育中的作用還不清楚，只是發(fā)現(xiàn)Notch受體2、3和配體Jagged2表達于顆粒細胞，配體Jagged1表達于卵母細胞，Notch受體1、4和配體Jagged1表達于卵巢血管以及黃體的新生血管，但對于它們在哺乳動物卵泡發(fā)育中的作用還一無所知。轉(zhuǎn)錄因子RBP-

2、J是Notch信號途徑在細胞核內(nèi)的主要效應(yīng)物，我們在已建立的RBP-J條件性剔除小鼠偶然發(fā)現(xiàn)，RBP-J的廣泛性敲除有時可引起卵巢體積的增大。石蠟切片、HE染色結(jié)果顯示，卵巢正常卵泡數(shù)目減少，髓質(zhì)所占比例增大，且沒有成熟卵泡和黃體形成。由于所建立的RBP-J條件性基因剔除小鼠屬于全身廣泛性敲除，RBP-J敲除對其他器官、系統(tǒng)的影響可能會間接的影響卵巢發(fā)育，而且用PolyI:C誘導(dǎo)RBP-J剔除所需時間較長，不利于觀察卵泡變化，因此我們利

3、用新生大鼠卵巢器官無血清離體培養(yǎng)體系來研究Notch信號途徑在卵泡發(fā)育中的作用。在培養(yǎng)過程中加入Notch信號途徑關(guān)鍵酶—γ-促分泌酶的抑制劑DAPT，初步探索了Notch信號通路在哺乳動物腔前卵泡發(fā)育中的作用。卵巢培養(yǎng)結(jié)束后，采用連續(xù)石蠟切片方法，計算整個卵巢中各期卵泡百分比、凋亡細胞數(shù)等。實驗結(jié)果提示：
　?。?）成功建立了新生大鼠卵巢器官無血清離體培養(yǎng)體系。取出生后四天大鼠卵巢培養(yǎng)，隔天換液，培養(yǎng)8天后Bouin氏液固定、包

4、埋、石蠟切片，HE染色觀察，組織結(jié)構(gòu)清晰，卵泡結(jié)構(gòu)完整、分期明確，卵泡較出生后四天有明顯的發(fā)育，提示卵巢培養(yǎng)成功。
　?。?）為了計算整個卵巢中各期卵泡數(shù)目，我們采用了如下方法：將一個卵巢作石蠟連續(xù)切片，蠟?zāi)ぐ辞衅樞驍[放，從起始5張蠟?zāi)さ娜我庖粡堥_始，每隔四張蠟?zāi)と∫粡垼瑢⑺∠災(zāi)颖驹贏PES膠片上展開，HE染色后在顯微鏡下計數(shù)各期卵泡數(shù)目，只有能夠看到卵母細胞核的卵泡才能夠被計算入內(nèi)，所計算的各期卵泡總數(shù)乘以校正因子5，即可

5、以得到該卵巢中各期卵泡的數(shù)目及卵泡總數(shù)。在卵巢培養(yǎng)中，我們加入了100μM、50μM和10μM不同工作濃度的DAPT，DAPT用DMSO配制，因此以加入DMSO組作為對照組。結(jié)果提示：加入抑制劑后，原始卵泡所占比例增大，發(fā)育至Stage4的卵泡明顯減少，因此我們認為阻斷Notch信號途徑后，腔前卵泡發(fā)育明顯受到抑制。
　?。?）HE染色切片中，加入抑制劑組有一些明顯的凋亡細胞，從其大小、形態(tài)、所處組織結(jié)構(gòu)判斷，這些凋亡細胞中既有卵

6、母細胞，也有顆粒細胞。計數(shù)整個卵巢中凋亡細胞數(shù)目，統(tǒng)計結(jié)果提示加入抑制劑后，凋亡細胞明顯增多。我們還利用TUNEL方法比較了卵巢最大切面的凋亡細胞數(shù)目，雖然實驗組間的差異與HE染色方法結(jié)果略有不同，但與對照組相比，其凋亡細胞數(shù)目都有明顯增加。
　　（4）在加入DAPT組的卵巢切片中，發(fā)現(xiàn)一些卵母細胞簇樣結(jié)構(gòu)，一個卵母細胞群最多可見超過10個卵母細胞。有的切片中這種結(jié)構(gòu)甚至成片連接。在對照組中，雖然也看到了卵母細胞在一起的結(jié)構(gòu)，但這

7、種結(jié)構(gòu)比較稀少，且沒有看到包括如此多卵母細胞的卵母細胞群，只是看到包括兩個、最多三個卵母細胞的結(jié)構(gòu)。計算每個卵巢中該結(jié)構(gòu)數(shù)目發(fā)現(xiàn)，實驗組明顯比對照組多。
　　（5）在卵巢培養(yǎng)中，我們收取并利用放免法檢測了培養(yǎng)基中雌二醇的含量，結(jié)果提示對照組與實驗組之間沒有明顯差異。
　?。?）為了初步分析哪些Notch相關(guān)分子可能參與了卵泡的發(fā)育，我們利用RT-PCR檢測了這些分子在卵巢中的表達。在Notch受體、配體中，除了配體Delta

8、-like3外，Notch受體1～4，配體Jagged1、2，Delta-like1、4在卵巢中均有表達。在這些卵巢有表達的分子中，Notch受體，配體Jagged1、2的表達已有相關(guān)文獻發(fā)表，但配體Delta-like1、4的表達及其定位還未有相關(guān)文獻。在下游分子HES1、3、5中，僅有HES1表達，但我們利用Westernblot未檢測到HES1的表達。
　　在出生后12天的大鼠卵巢中已經(jīng)明顯出現(xiàn)了有腔的卵泡。但在培養(yǎng)了8天的

9、卵巢中，并未出現(xiàn)，提示我們雖然成功培養(yǎng)了卵巢器官，但與在體比較，卵泡的發(fā)育明顯遲緩。而且由于培養(yǎng)時間的限制，卵泡也無法發(fā)育到成熟、排卵以及形成黃體，這些都說明我們尚無法在體外復(fù)制卵泡的發(fā)育過程。并且在卵巢的培養(yǎng)中影響因素較多，例如我們常常難以同時拿到出生四天的大鼠卵巢。因此我們擬建立卵巢特異性RBP-J剔除小鼠來進一步研究Notch信號途徑在哺乳動物卵泡發(fā)育中的作用。
　　在卵泡發(fā)育過程中，顆粒細胞與卵母細胞的相互作用是卵泡發(fā)育和

10、維持正常功能的重要條件。結(jié)合已發(fā)表文獻，在卵泡中，Notch受體僅表達于顆粒細胞，并不表達于卵母細胞、膜細胞，因此我們擬建立卵巢顆粒細胞特異性的RBP-J剔除小鼠來進一步研究Notch信號途徑在哺乳動物在卵泡發(fā)育中的作用，在本實驗中，我們克隆了卵巢顆粒細胞特異性啟動子MIS2Rpr，確定其活性與組織特異性后將其克隆入Cre重組酶上游，雙酶切后可以獲得線性化的MIS2Rpr/CreN，為建立卵巢顆粒細胞特異性表達Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小鼠，進