誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶在糖尿病大鼠晶狀體上皮細(xì)胞凋亡中表達(dá)的研究.pdf

1、目的：一氧化氮(NO)是組織內(nèi)常見的氧化自由基，高度活躍。少量NO可以維持機(jī)體正常的生理需求。而大量的NO會對組織細(xì)胞造成氧化損傷。一氧化氮合成酶(NOS)是體內(nèi)主要的NO合成限速酶，分為Ⅲ型：Ⅰ和Ⅲ型受細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>的調(diào)節(jié)，催化生成少量NO，維持機(jī)體需要。Ⅱ型又稱誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)，在一定的刺激下，才被激活，催化生成NO。本實驗應(yīng)用鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，觀察iNOS在糖尿

2、病大鼠晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況，以及iNOS的表達(dá)與細(xì)胞凋亡酶一半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)之間的關(guān)系。并用胰島素(INS)進(jìn)行干預(yù)治療，旨在探討iNOS在糖尿病性白內(nèi)障病變過程中的作用，并為臨床用藥提供理論及實驗依據(jù)。 方法：選擇體重在200±10g，健康無熱源并無眼疾的雄性sprague-Dawlve(SD) 大鼠40只，并隨機(jī)分為6只正常組大鼠和34只糖尿病模型組大鼠。適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，34只糖尿病模型組大鼠禁食

3、，自由飲水24小時后，采用腹腔內(nèi)注射sTZ(55mg/kg)誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，3天后采尾靜脈血，確認(rèn)血糖≥16mmol/L，多飲、多食、多尿為造模成功。34只隨機(jī)分為糖尿病組10只；治療組10只；對照組10只。(其中2只血糖未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，2只由于血糖過高，死于并發(fā)癥，未加入實驗)。糖尿病組大鼠和正常組大鼠正常喂養(yǎng)；治療組大鼠每天皮下注射INS(10單位/kg)；對照組大鼠每天皮下注射PBS緩沖液(1ml/kg)。整個實驗過程中用裂隙燈顯

4、微鏡觀察大鼠晶狀體的形態(tài)學(xué)變化。分別在造模成功后的第4周、8周，分別處死每組的5只動物(正常組3只動物)。取一側(cè)晶狀體做電鏡切片觀察晶狀體上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。取另一側(cè)晶體固定后，做病理切片及用免疫組化的方法測定各組晶狀體上皮細(xì)胞中不同時段iNOS、3-硝基酪氨酸(3-NT)、Caspase-3在蛋白水平的表達(dá)。用Image-pro Plus軟件對免疫組化顯色結(jié)果進(jìn)行拍照、灰度分析。應(yīng)用SPSS13.0軟件，采用單因素方差分析和配對t

5、檢驗的方法，做統(tǒng)計學(xué)的分析。視P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果： 1．光鏡：正常組大鼠晶狀體上皮細(xì)胞形態(tài)未見明顯的變化。糖尿病組大鼠晶狀體上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞排列紊亂，胞核邊集等細(xì)胞凋亡的表現(xiàn)。治療組的變化較糖尿病組明顯減輕。對照組的變化同糖尿病組。 2．電鏡：正常組大鼠的晶狀體上皮細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞器(線粒體)及細(xì)胞間連接未見明顯的變化。糖尿病組大鼠晶狀體上皮細(xì)胞的細(xì)胞核出現(xiàn)核固縮、線粒體腫脹，細(xì)胞間連接疏松，明顯細(xì)

6、胞凋亡的表現(xiàn)。治療組的變化較糖尿病組明顯減輕。對照組的變化同糖尿病組。 3．免疫組化： (1)正常組大鼠晶狀體上皮細(xì)胞中無iNOS表達(dá)。在持續(xù)高血糖的狀態(tài)下，大鼠晶狀體上皮細(xì)胞開始出現(xiàn)iNOS的表達(dá)。 (2)隨著iNOS表達(dá)的增加，細(xì)胞中NO的含量增加，NO使細(xì)胞中的酪氨酸硝基化，生成3-NT，對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。同時細(xì)胞中凋亡核心酶—Caspase-3被激活，表達(dá)逐漸增加，引起細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)。 (3