3T3中性紅攝取試驗(yàn)方法在皮膚光毒性效應(yīng)中的應(yīng)用研究.pdf

1、光毒效應(yīng)(phototoxicity)是指化學(xué)物質(zhì)通過接觸、口服、注射等途徑進(jìn)入體內(nèi)，與一定照射劑量的光線或紫外線接觸后產(chǎn)生的皮膚毒性反應(yīng)、遲發(fā)性免疫反應(yīng)和致突變反應(yīng)?？僧a(chǎn)生光毒性的化學(xué)物質(zhì)很多，常見報(bào)道的多為一些藥物及功能性化妝品(特殊用途化妝品)原料如氯丙嗪、斯帕沙星、氟喹諾酮、噻嗪、酚噻嗪、磺胺、喹啉、鹽酸氯丙嗪、苯酮、六-甲基香豆素、三氯生、貫葉金絲桃提取物、某些香料如茉莉、肉桂、葵子麝香等。 目前國內(nèi)外用于化學(xué)品光毒效

2、應(yīng)安全性評價(jià)的試驗(yàn)主要包括人體斑貼試驗(yàn)(Humanskinpatchtest)、動物(豚鼠，兔及大鼠等)皮膚光照試驗(yàn)(skinphotoxicitytest)和體外試驗(yàn)(invitrotest)。人體斑貼實(shí)驗(yàn)的結(jié)果真實(shí)，能較理想評價(jià)化學(xué)物質(zhì)對人體的光毒效應(yīng)，但存在樣本難得、人群依從性和倫理學(xué)問題；動物試驗(yàn)操作簡單，方法成熟，但將動物試驗(yàn)結(jié)果外推到人存在種群差異，并且對動物存在一定的傷害，自本世紀(jì)初以來受到了動物保護(hù)組織和一些科研工作者的

3、抨擊；而體外試驗(yàn)有證據(jù)表明其結(jié)果與體內(nèi)試驗(yàn)的相關(guān)性也較好，同時又不存在體內(nèi)試驗(yàn)有關(guān)的倫理問題，且費(fèi)用相對較低，因此近年來，隨著社會文明的進(jìn)步、科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及世界上一些動物保護(hù)組織施加的社會壓力等方面原因，歐、美、日等發(fā)達(dá)工業(yè)國家化妝品安全性評價(jià)已趨向于向“3R原則(替代、減少、優(yōu)化)”轉(zhuǎn)化，采用體外方法替代體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行皮膚光毒安全性評價(jià)已成為毒理學(xué)安全性評價(jià)領(lǐng)域迫切需要解決的熱點(diǎn)問題。 研究目的:引進(jìn)并建立3T3中性紅攝取光

4、毒試驗(yàn)的體外試驗(yàn)方法，通過對已知化學(xué)物質(zhì)和化妝品光毒性檢測的應(yīng)用與比較，初步評價(jià)該實(shí)驗(yàn)方法在我國化妝品和化學(xué)日用品安全性評價(jià)工作中實(shí)際應(yīng)用的可能性，為制訂和完善新的標(biāo)準(zhǔn)與規(guī)范提供依據(jù)。 材料與方法: 1.使用3T3細(xì)胞進(jìn)行中性紅攝取體外光毒性試驗(yàn)并與與已知的光毒性陽性數(shù)據(jù) 庫進(jìn)行比較參照OECD的數(shù)據(jù)庫(1999)，選擇24種已知光毒性的化學(xué)物質(zhì)作為受試物，包括6-甲基香豆素、8-甲氧補(bǔ)骨脂素、胺碘酮、蒽、硫氯酚

5、、鹽酸氯丙嗪、氯丙嗪、去甲金霉素、鹽酸去甲金霉素、酮洛芬、葵子麝香、中性紅、諾氟沙星、異丙嗪、鹽酸異丙嗪等15種光毒陽性物質(zhì)；月桂硫酸鈉、二苯甲酮、鹽酸洗必太、六氯酚、L-組氨酸、甲氧基肉桂酸辛酯、水楊酸辛酯、P-氨基苯甲酸、盤尼西林等9種光毒陰性物質(zhì)，使用Balb/c3T3細(xì)胞進(jìn)行中性紅攝取體外光毒性試驗(yàn)并將結(jié)果與已知的光毒性陽性數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，同時選擇小部分陽性物質(zhì)進(jìn)行動物試驗(yàn)。 1)細(xì)胞染毒 ①復(fù)蘇后經(jīng)培養(yǎng)生長良好

6、的3T3細(xì)胞，計(jì)數(shù)并準(zhǔn)備為1×105/ml的細(xì)胞懸液。于96孔培養(yǎng)板(外圍一圈除外)中每孔加入100μl細(xì)胞懸液(=1×104細(xì)胞/孔)。每個受試物，準(zhǔn)備兩個平板：一個用于確定細(xì)胞毒性(-UVA)，而另一個用于確定光毒性(+UVA)。 ②細(xì)胞培養(yǎng)24小時(7.5％CO2，37℃)，形成半融合單層細(xì)胞。 ③棄去培養(yǎng)液，用150μl的EBSS/PBS沖洗兩次。添加100μl溶有適當(dāng)濃度的受試物EBSS/PBS。培養(yǎng)細(xì)胞1小時

7、(7.5％CO2，37℃)。96孔板的外圍孔為空白試劑對照，第2、11行為陰性對照，3-10行分八個劑量組進(jìn)行染毒。 ④+UVA測定：在室溫下以1.7mW/cm2光強(qiáng)度透過96孔板蓋照射細(xì)胞10分鐘。室溫下，將同樣的平板(-UVA)置于暗處同+UVA暴露時間。 ⑤棄去受試溶，用150μl的EBSS/PBS沖洗兩次。換新培養(yǎng)液37℃，7.5％CO2培養(yǎng)過夜。 ⑥次日在相差顯微鏡下檢查細(xì)胞。記錄受試物細(xì)胞毒性所致細(xì)胞

8、形態(tài)學(xué)的改變。 2)中性紅吸收(NRU)測量 ①用150μl預(yù)先加溫的EBSS/PBS沖洗細(xì)胞。添加100μl的中性紅(NR)培養(yǎng)液，37℃，7.5％CO2，濕度適宜的環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞3小時。 ②吸棄NR培養(yǎng)液，用150μ1EBSS/PBS沖洗細(xì)胞。 ③棄去全部的EBSS/PBS。 ④添加150μl的NR(1％冰醋酸+50％乙醇+49％H2O)提取溶液，在微量滴定平板振蕩器上迅速震蕩微量滴定平板10

9、分鐘，直至NR已從細(xì)胞內(nèi)被提取出來并形成均質(zhì)的溶液。 ⑤酶標(biāo)儀測量溶液在540nm波長處的光密度。以標(biāo)準(zhǔn)ASCII格式保存數(shù)據(jù)文件，隨后以Photo32軟件進(jìn)行PIF及MPE分析。判斷標(biāo)準(zhǔn)為：如果PIF＜5：預(yù)測無潛在光毒性；如果PIF＞5：預(yù)測有潛在光毒性。 如果MPE＜0.1：預(yù)測無潛在光毒性；如果MPE＞.01：預(yù)測有潛在光毒性。與已知的化學(xué)物質(zhì)光毒性數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。 2.使用部分特殊用途化妝品進(jìn)行中性紅攝

10、取體外光毒性試驗(yàn)、并對應(yīng)使用成年白化豚鼠進(jìn)行傳統(tǒng)的整體動物光毒性試驗(yàn)，比較分析兩種試驗(yàn)的結(jié)果選擇千葉防曬霜、剔透雙重美白防曬露等二十種防曬、祛斑、育發(fā)類特殊用途化妝品，進(jìn)行中性紅攝取體外光毒性試驗(yàn)的同時，使用成年白化豚鼠進(jìn)行動物光毒性試驗(yàn)，將兩者的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較分析。 3T3細(xì)胞的光毒性試驗(yàn)同上。整體動物的光毒性試驗(yàn)步驟如下： ①試驗(yàn)前18h～24h，將動物脊柱兩側(cè)皮膚去毛，試驗(yàn)部位皮膚需完好，無損傷及異常。備4塊去

11、毛區(qū)(左右各2，相向排列)，每塊去毛面積約為2cm×2cm。 ②將動物固定，在動物去毛區(qū)上兩區(qū)涂敷0.2mL(g)受試物，下兩區(qū)為空白對照。30min后，左側(cè)用鋁箔復(fù)蓋，膠帶固定，右側(cè)用UVA進(jìn)行照射。 ③結(jié)束后分別于1、24、48和72h觀察皮膚反應(yīng)，根據(jù)我國的“化妝品衛(wèi)生規(guī)范”中相關(guān)試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)，判定每只動物皮膚反應(yīng)評分。 對兩種試驗(yàn)方法所獲得的結(jié)果進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)與體外試驗(yàn)的一致性比較，以確定兩種方法有無差異。

12、并計(jì)算靈敏度(真陽性率，TPR)，特異度(Spe)，陽性預(yù)測價(jià)值(PV+)，陰性預(yù)測價(jià)值(PV-)，假陽性率(FPR)，陽性似然比(LR+)及Youden指數(shù)、Kappa指數(shù)等，并進(jìn)行分析比較。 試驗(yàn)結(jié)果: 1.已知其光毒性的24種(15陽9陰)化學(xué)物質(zhì)的3T3細(xì)胞中性紅攝取體外光毒性試驗(yàn)結(jié)果如下：24種已知光毒性的受試物，包括6-甲基香豆素、8-甲氧補(bǔ)骨脂素、胺碘酮、蒽、硫氯酚、鹽酸氯丙嗪、氯丙嗪、去甲金霉素、鹽酸去甲

13、金霉素、酮洛芬、葵子麝香、中性紅、諾氟沙星、異丙嗪、鹽酸異丙嗪等15種光毒陽性物質(zhì)；月桂硫酸鈉、二苯甲酮、鹽酸洗必太、六氯酚、L-組氨酸、甲氧基肉桂酸辛酯、水楊酸辛酯、P-氨基苯甲酸、盤尼西林等9種光毒陰性物質(zhì)，使用Balb/c3T3細(xì)胞進(jìn)行中性紅攝取體外光毒性試驗(yàn)結(jié)果為，15個陽性物質(zhì)中測出除胺碘酮外，有14個呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，9個陰性物質(zhì)均為陰性反應(yīng)。 無論以PIF或MPE作判斷標(biāo)準(zhǔn)，其靈敏度(TPR)均為93.3％，特異度(S

14、pe)為100％，陽性預(yù)測價(jià)值(PV+)為1，陰性預(yù)測價(jià)值(PV-)為0.9，假陽性率(FPR)為6.7％，陽性似然比(LR+)為13.93，Youden指數(shù)(J)為0.866，Kappa指數(shù)k為0.91，均十分接近1。 2.部分特殊用途化妝品同時進(jìn)行中性紅攝取體外光毒性試驗(yàn)及傳統(tǒng)的整體動物光毒性試驗(yàn)，兩種試驗(yàn)的結(jié)果如下：本次研究中的20種化妝品終產(chǎn)品，整體動物光毒性試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。不論是基于PIF還是基于MPE的3T3細(xì)胞光

15、毒性試驗(yàn)，所測定的結(jié)果也均為陰性，與動物試驗(yàn)結(jié)果完全相同。 以上兩部分試驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)室中建立的3T3細(xì)胞光毒性試驗(yàn)方法，已經(jīng)與動物實(shí)驗(yàn)方法基本一致。 結(jié)論: 1.本研究在我國率先成功建立了用于光毒性試驗(yàn)的體外替代方法——3T3中性紅攝取試驗(yàn)。 2.與整體動物光毒性試驗(yàn)結(jié)果比較，陽性物、陰性物和實(shí)測的化妝品在體外試驗(yàn)方法中均有較高的一致性和良好的結(jié)果再現(xiàn)性。 3.3T3中性紅攝取試驗(yàn)快速、靈敏