EB病毒自身融合衣殼抗原的研制和應(yīng)用.pdf

1、目的：原核表達(dá)EB病毒(Epstein.Barr virus，EBV)衣殼蛋白p23-p18融合蛋白，研制EBV特異性衣殼抗原(viralcapsid antigen，VCA)抗體ELISA檢測試劑。 方法： 1.選擇p23編碼基因BLRF2(氨基酸1～162)和p18編碼基因BFRF3的C端(氨基酸105～176)基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，以EBV標(biāo)準(zhǔn)株B95-8為模板，采用重疊延伸PCR技術(shù)，將兩段基因通過多肽接頭(

2、Gly4Ser)3 DNA序列連接以獲得融合基因p23-p18。 2.融合基因經(jīng)測序證實(shí)序列準(zhǔn)確無誤后，導(dǎo)入表達(dá)載體pThioHis A構(gòu)建原核表達(dá)克隆，轉(zhuǎn)染E.coli BL21后IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，重組蛋白經(jīng)鎳-敖合物瓊脂糖樹脂柱親和層析純化獲得融合抗原，Western blot鑒定其特異性。 3.用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清滴定抗原效價，選擇最適濃度包被ELISA反應(yīng)板，配套商品化的辣根過氧化酶標(biāo)羊抗人IgM、IgG及其它一系列試

3、劑，反復(fù)優(yōu)化反應(yīng)條件，組裝成EBV特異性VCA IgM和IgG間接ELISA診斷試劑。 4.選擇血清標(biāo)本進(jìn)行檢測，并與“金”標(biāo)準(zhǔn)即間接免疫熒光(IFA)和NOVATEC公司生產(chǎn)的VCA IgM和IgG ELISA檢測試劑盒進(jìn)行比較，計(jì)算該試劑的敏感性、特異性、約登指數(shù)、符合率、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值等指標(biāo)，同時檢測診斷試劑的重復(fù)性和穩(wěn)定性。 結(jié)果：p23和p18融合基因成功構(gòu)建并有效表達(dá)，Western blot顯示融合

4、抗原具有較高的特異性和敏感性。與IFA比較，采用融合衣殼抗原制備的EBV VCAIgG診斷試劑盒的敏感性、特異性、約登指數(shù)、符合率、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為97.3％、97.4％、0.947、97.3％、99.8％和77.6％；IgM ELISA診斷試劑盒的上述各項(xiàng)指標(biāo)分別為94.8％、99.5％、0.943、98.7％、97.3％和98.9％。融合抗原ELISA與NOVATEC公司同類產(chǎn)品有較高的符合率(IgG為97.7％，IgM