抗新城疫病毒核衣殼蛋白單克隆抗體的研制及特性研究.pdf

1、新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一種極易傳染的烈性傳染病，自1926年發(fā)現(xiàn)并分離到病毒，新城疫至今還在世界范圍內(nèi)發(fā)生、流行，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重危害。新城疫病毒核衣殼蛋白是組成核衣殼最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，也可能是刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)的成分。NP蛋白的主要功能是與P(磷蛋白)和L(大蛋白)結(jié)合包裹基因組RNA形成一個(gè)螺旋的核糖核蛋白(RNP)復(fù)合體

2、，在基因組RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的過(guò)程中起著非常重要的作用。本研究以NDV F48E8株為研究對(duì)象，以Genbank公布的NDV SRZ03株基因序列(登陸號(hào)：EU167540)為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用RT-PCR方法對(duì)NP基因進(jìn)行了克隆，經(jīng)序列測(cè)定和分析正確后，進(jìn)行了原核表達(dá)，制備了針對(duì)NP蛋白的單克隆抗體，為新城疫病毒的深入研究及臨床檢驗(yàn)提供了新材料。
　　 ㈠新城疫病毒NP基因的克隆及序列分析。利用德國(guó)AXYGEN公司的總RNA

3、小量提取試劑盒提取NDV F48E8株的RNA，根據(jù)Genbank公布的NDV SRZ03株基因序列(登陸號(hào)：EU167540)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用RT-PCR的方法成功擴(kuò)增出了NDV F48E8株的NP基因，并將擴(kuò)增片段克隆至pGEM-T Easy載體中。利用DNAstar5.0進(jìn)行核苷酸序列分析表明，目的基因核苷酸序列長(zhǎng)為1470bp；該序列與NDV其他代表毒株的NP基因序列比較分析結(jié)果顯示，與其他強(qiáng)毒株的核苷酸同源性為77.4

4、％～99.8％，氨基酸同源性為91.2％～99.2％；與中等毒株的核苷酸同源性為87.3％，氨基酸同源性為93.9％；與弱毒株的核苷酸同源性為84.9％86.6％，氨基酸同源性為90.2％～93.5％。
　　 ㈡NDV NP蛋白的可溶性表達(dá)、純化及應(yīng)用。將NP基因片段經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切從pGEM-T-NP重組載體上切下，連接至pGEX-6P-1表達(dá)載體中，經(jīng)酶切鑒定后將含有NP基因的陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL

5、21感受態(tài)細(xì)胞中，篩選重組菌pGEX-6p-1-NP/BL21，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot分析表明，獲得的融合蛋白主要以包涵體的形式出現(xiàn)，分子量約為79kDa，大小與預(yù)期相一致。為了獲得可溶性表達(dá)的NP蛋白，以結(jié)核桿菌的CFP10基因插入pGEX-6p-1-NP重組質(zhì)粒，構(gòu)建CFP10-NP-GST融合表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定后，陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定。將含有CFP10基因的陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化E.col

6、i BL21感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組菌pGEX-6p-1-CFP10-NP/BL21，分別以不同濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，并設(shè)25℃、28℃、37℃三個(gè)溫度梯度誘導(dǎo)，通過(guò)SDS-PAGE和Western-blot進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物分析。結(jié)果表明IPTG終濃度為0.75mmol/L在28℃下誘導(dǎo)5h達(dá)到表達(dá)高峰，融合蛋白為可溶性表達(dá)，分子量約為89kDa，大小與預(yù)期相一致。融合蛋白免疫小鼠后，采取血清，間接免疫熒光檢測(cè)后顯示NP融合蛋白具有良好的抗原

7、特異性。將誘導(dǎo)表達(dá)的可溶性融合蛋白經(jīng)GST-瓊脂糖凝膠柱純化，純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot分析，結(jié)果顯示成功獲得純化的NP重組蛋白。利用該純化NP蛋白建立新城疫病毒抗體間接ELISA檢測(cè)方法，并與HI及中和試驗(yàn)進(jìn)行抗體相關(guān)性分析，結(jié)果顯示間接ELISA與HI方法存在一定的相關(guān)性，但二者與中和作用的相關(guān)性不大。
　　 ㈢抗NDV NP蛋白單克隆抗體的制備及鑒定。本研究通過(guò)NDV全病毒及原核表達(dá)的重組NP蛋白

8、兩種不同的免疫原分別免疫BALB/C小鼠。免疫五次，最后一次免疫后72h內(nèi)取免疫鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。融合后的雜交瘤分別采用間接ELISA及間接免疫熒光兩種體系篩選陽(yáng)性克隆，并采用有限稀釋法對(duì)其進(jìn)行亞克隆，結(jié)果共獲得7株能穩(wěn)定分泌抗NDV NP蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為NDV-NP-2G4、 NDV-NP-2E9、NDV-NP-1F8、NDV-NP-1E9、NDV-NP-4G9、 NDV-NP-589、NDV