漢坦病毒核衣殼蛋白抗原多肽片段的合成與應(yīng)用

1、<p>　　漢坦病毒核衣殼蛋白抗原多肽片段的合成與應(yīng)用</p><p>　　【關(guān)鍵詞】 腎綜合征出血熱 </p><p>　　關(guān)鍵詞 :腎綜合征出血熱;漢坦病毒;病毒殼體;表位作圖;肽合成;酶聯(lián)免疫吸附測定 </p><p>　　摘 要:目的 以合成肽為抗原建立新型特異性檢測抗?jié)h坦病毒IgG和IgM的ELISA. 方法 用多肽合成儀合成漢坦病毒核衣

2、殼蛋白（aa17-66）50個(gè)氨基酸殘基的核心序列，以此為抗原，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這一序列具有較強(qiáng)的抗原性，首次建立了以合成肽為抗原的新型特異性檢測抗?jié)h坦病毒IgG和IgM的ELISA.測定腎綜合征出血熱（HFRS）患者血清23份，乙型肝炎患者血清9份，正常人血清11份. 結(jié)果 乙型肝炎患者血清和正常人血清均為陰性，20份HFRS血清IgG陽性，21份HFRS血清IgM陽性.本方法的相對敏感性為86%和91%，相對特異性為100%，符合率為

3、93%和95%. 結(jié)論 本法特異性強(qiáng)，靈敏度高，簡便易行，是適于基層醫(yī)療單位的診斷方法. </p><p>　　Keywords:hemorrhagic fever with renal syndrome;Hantaan-virus;capsid;epitope mapping;peptide synthe-sis;enzyme-linked immunostorbent assay </p>&

4、lt;p>　　Abstract:AIM To establish a new specific serological diag-nostic method to test HFRS.METHODS Epitope（aa17-66）of nucleocapsid protein was synthesized by solid-phase pep-tide synthesis.Then the synthetic peptide

5、was applied as an antigen to test the specific antibody（IgG，IgM）by ELISA.Twenty-three sera from HFRS patients，9from HBV patients and11from healthy people were detected.RESULTS All sera from HBV patients and healthy peopl

6、e were negative，20from HFRS patients for anti-HV IgG positive and21ser</p><p><b>　　0 引言 </b></p><p>　　腎綜合征出血熱（HFRS）為布尼亞病毒科漢坦病毒屬病毒（Hantavirus，HV）引起的自然疫源性傳染病，我國是HFRS流行的主要國家［1-3］ .HV基因組

7、由L，M，S三個(gè)片段構(gòu)成，分別編碼病毒RNA聚合酶、囊膜糖蛋白G1和G2及核衣殼蛋白（簡稱核蛋白，Nucleocapsid protein，NP）［4，5］ .囊膜糖蛋白上具有中和及血凝抗原位點(diǎn)，可誘導(dǎo)中和抗體和保護(hù)性細(xì)胞免疫反應(yīng);核蛋白上雖無中和性抗原位點(diǎn)，但仍可誘導(dǎo)保護(hù)性細(xì)胞免疫，現(xiàn)有研究表明，在核蛋白上也可能有中和性抗原位點(diǎn)存在［6，7］ .血清學(xué)研究表明，漢坦病毒核蛋白具有很強(qiáng)的抗原性和免疫原性，患者對核蛋白的抗體不僅出現(xiàn)早，且

8、滴度高［8］ .應(yīng)用單克隆抗體進(jìn)行的研究表明，抗NP血清或單抗雖然沒有中和活性，但用NP免疫的動(dòng)物仍可產(chǎn)生一定的抗病毒免疫［9-11］ .此外還發(fā)現(xiàn)抗NP血清或單抗可與多種血清型病毒抗原產(chǎn)生交叉反應(yīng)，而NP抗原也可與漢坦病毒屬內(nèi)的多種血清型病毒的免疫血清產(chǎn)生交叉反應(yīng)，表明漢坦病毒NP具有共同的抗原決定簇［12，13］ .Vapalahti等［9］ 應(yīng)用PERSCAN技術(shù)，對連續(xù)交錯(cuò)合成的覆蓋NP全</p><p>

9、;　　我們根據(jù)以上結(jié)果，用Antheprot4.3蛋白序列分析軟件包，通過計(jì)算機(jī)對S片段編碼蛋白各區(qū)域進(jìn)行親疏水性、抗原性和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測.采用固相多肽合成法合成了NP（aa17-66）多肽.發(fā)現(xiàn)這個(gè)多肽序列抗原性較強(qiáng)，同時(shí)建立了以合成肽為抗原的新型特異性檢測抗?jié)h坦病毒IgG和IgM的ELISA測定法. </p><p><b>　　1 材料和方法 </b></p><p&

10、gt;<b>　　1.1 材料 </b></p><p>　?、匐暮铣蓛x及其主要試劑:Pioneer Peptide Synthesis System（先鋒多肽合成儀）、9-芴基甲基氧羰基（Fmoc）-PAL-PEG-PS樹脂、Fmoc-L-氨基酸、縮合劑:O-苯并三唑基-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸（TBTU）、脫保護(hù)劑:200g&#12539;L-1 哌啶的二甲基甲酰胺

11、溶液、二甲基甲酰胺（DMF）、二異丙基乙胺（DIEA）、三氟乙酸（美國PerSeptive Biosystems公司）;甲醇（HPLC級(jí)）（天津四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司產(chǎn)品）;苯甲基硫醚、1，2-巰基乙烷、苯甲基醚（Sigma公司產(chǎn)品）;②血清標(biāo)本:收集西安地區(qū)腎綜合征出血熱患者血清23份，乙型肝炎患者血清9份，正常人血清11份.③ELISA試劑:采用丹麥產(chǎn)96孔可拆式Nunc Maxi Sorp聚苯乙烯酶標(biāo)板，包被抗原用的緩沖液為0.

12、02mol&#12539;L-1 pH8.0Tris-HCl緩沖液;封閉液為10g&#12539;L-1 明膠的0.02mol&#12539;L-1 pH7.4PBS或300mL&#12539;L-1 滅活小牛血清的PBST，0.02mo</p><p><b>　　1.2 方法 </b></p><p>　　1.2.1 NP序列的計(jì)算

13、機(jī)模擬分析 </p><p>　　用Anthep-rot4.3蛋白序列分析軟件包，通過計(jì)算機(jī)對S片段編碼蛋白各區(qū)域進(jìn)行親疏水性、抗原性和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測.確定NP抗原表位多肽的氨基酸序列. </p><p>　　1.2.2 NP（aa17-66）抗原表位多肽的合成 </p><p>　　在先鋒多肽合成儀上起始Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂，按多肽序列從C端逐

14、個(gè)向N端延伸.所用保護(hù)基團(tuán)是:各氨基酸的α-氨基為Fmoc-保護(hù).其中有些殘基側(cè)鏈帶有保護(hù)基團(tuán)，它們是:Gln（三苯甲基（Trt）），Arg（2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-苯磺?；╬bf）），Lys（叔丁基氧羰基（Boc）），Asp（叔丁酯（Ot-Bu）），Glu（OtBu），Asn（Trt），Ser（叔丁基（tBu）），Thr（tBu），Tyr（tBu）.用200g&#12539;L-1 哌啶的二甲基甲酰胺溶液

15、脫除Fmoc保護(hù)基，加TBTU以活化保護(hù)氨基酸的羧基，合成了50個(gè)氨基酸殘基多肽.合成儀自動(dòng)在線檢測每一個(gè)氨基酸的連接效率. </p><p>　　1.2.3 合成肽的裂解與去除保護(hù)基團(tuán) </p><p>　　肽合成后，把結(jié)合有肽的樹脂放入真空干燥器中，干燥4h，然后用三氟乙酸、苯甲基硫醚、苯甲基醚、1，2-巰基乙烷，按體積比90∶5∶2∶3比例混合，室溫避光處理4h;把肽鏈從樹脂上裂

16、解下來，同時(shí)除去肽鏈上其它保護(hù)基.然后過濾到冷乙醚中，此時(shí)有白色沉淀產(chǎn)生;再用不同濃度的醋酸抽提肽，冷凍干燥;經(jīng)Sephadex G-25柱脫鹽，再經(jīng)高壓液相反相層析柱C18分離純化，得到HPLC純的肽. </p><p>　　1.2.4 合成肽的包被及封閉 </p><p>　　用包被緩沖液將多肽抗原稀釋至10mg&#12539;L-1 ，酶標(biāo)板每孔加入0.1mL，置37℃1

17、2h后棄去包被液，甩干后每孔加封閉液0.2mL，置37℃2h.洗滌3次，每次在加滿洗滌液后放置3～5min，然后用力甩干液體，拍干.封裝后4℃貯存供間接ELISA法檢測抗HFRS用.每孔加入0.1mL預(yù)先用稀釋液稀釋100倍的血清標(biāo)本（測抗HFRS IgM時(shí)，在稀釋血清標(biāo)本中加入10μL羊抗人IgG），置37℃培養(yǎng)箱保溫1h.洗滌5次，再每孔加入酶標(biāo)記的羊抗人IgG或IgM0.1mL，37℃溫育45min.洗滌5次，每孔加入0.1mL新

18、鮮配制的底物液，置37℃反應(yīng)15min.最后每孔加2mol&#12539;L-1 硫酸25μL終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上（波長=492nm）測定每孔吸光度A（OD值）.3個(gè)陰性血清的平均A值加3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差（x ±3s）為本方法陽性判斷值. </p><p><b>　　2 結(jié)果 </b></p><p>　　2.1 NP序列的計(jì)算機(jī)模擬分析 </p&

19、gt;<p>　　對S片段編碼蛋白各區(qū)域進(jìn)行親疏水性、抗原性和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測.發(fā)現(xiàn)NP（aa17-66）區(qū)段親水性高，含α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角及β-折疊區(qū)域，并易形成折曲抗原表位（Fig1）. 表1 NP（aa17-66）合成肽的氨基酸組成分析（略） </p><p>　　2.2 肽合成效率及合成肽的純化和鑒定 </p><p>　　先鋒多肽合成儀能自動(dòng)在線檢測每一個(gè)氨基酸的連

20、接效率.Fig2為先鋒多肽合成儀合成多肽時(shí)自動(dòng)顯示的合成的情況，圖上的每一個(gè)條柱代表一個(gè)氨基酸的偶聯(lián)情況，條柱的高低反映了每一個(gè)氨基酸的連接效率，如果某個(gè)條柱低于一定的數(shù)值時(shí)，合成儀能自動(dòng)停止合成，并顯示合成失敗.根據(jù)Fig2，本次合成的多肽每一步聯(lián)接效率均在95%以上.合成的NP（aa17-66）肽段位于NP的氨基端親水區(qū).經(jīng)Sephadex G-25脫鹽，再經(jīng)高壓液相反相層析柱C18分離純化，得到HPLC單一峰的肽，如Fig3所示.

21、所用色譜的色譜柱為ODS柱（C18，250mm×4.6mm）;流動(dòng)相:A為甲醇，B為異丙醇;梯度洗脫時(shí)間為50min，流動(dòng)相A從100%變化到0，B從0變化到100%;流速為0.5mL&#12539;min-1 ;檢測波長280nm.最后經(jīng)氨基酸分析儀分析，此肽的氨基酸組成符合其理論值（Tab1）. 表2 不同包被液對檢測結(jié)果的影響（略） </p><p>　　2.3 多肽抗原包被液及封閉液的選

22、擇 </p><p>　　用0.02mol&#12539;L-1 pH8.0Tris-HCl，0.02mol&#12539;L-1 pH7.2PBS和0.05mol&#12539;L-1 pH9.6碳酸鹽緩沖液包被多肽抗原，在相同條件下測定陽性、陰性血清.據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定3種包被液的包被效果（Tab2）.可見，用Tris-HCl作抗原包被液，陽性血清A值最高，故我們采用Tris-HCl包

23、被液.分別用10g&#12539;L-1 明膠0.02mol&#12539;L-1 pH7.4PBS（1號(hào)）、300mL&#12539;L-1 滅活小牛 血清PBST，0.02mol&#12539;L-1 pH7.4PBS，0.5g&#12539;L-1 Tween-20（2號(hào)）和內(nèi)含50g&#12539;L-1 脫脂奶粉的0.02mol&#12539;L-1 pH7.2PBS（3

24、號(hào)），封閉多肽抗原，在相同條件下測定陽性、陰性血清，觀察3種封閉液的效果（Tab3）.可見，用1號(hào)或2號(hào)作抗原封閉液，陽性血清與陰性血清吸光值差異大，相差大于20倍.而3號(hào)作抗原封閉液，陽性血清與陰性血清吸光值差異小，相差小于3倍，特別是大部分陰性血清A</p><p>　　2.4 方法的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性 </p><p>　　實(shí)驗(yàn)標(biāo)本為抗HFRS IgG及IgM均呈陽性的3份患

25、者血清.抗HFRS IgG的批內(nèi)變異系數(shù)（CV）為3.3%～4.8%;批間CV為8.1%～11.0%（Tab4）.抗HFRS IgM的批內(nèi)CV為3.8%～5.3%;批間CV為7.2%～9.1%.由此表明本方法的批內(nèi)及批間均符合精密度的標(biāo)準(zhǔn)要求.把已包被多肽抗原的聚苯乙烯酶標(biāo)板進(jìn)行封閉、干燥后置4℃冰箱保存，每隔一定時(shí)間測定1次，觀察板上抗原的穩(wěn)定性，共觀察了5mo，測定結(jié)果無明顯差異.提示多肽抗原板在4℃至少可穩(wěn)定5mo.表4 抗HFR

26、S ELISA的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略） </p><p>　　2.5 血清標(biāo)本的測定 </p><p>　　用本法測定HFRS患者血清23份，乙型肝炎患者血清9份，正常人血清11份. </p><p>　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎患者血清和正常人血清均為陰性，20份HFRS血清IgG陽性，21份HFRS血清IgM陽性.本方法的相對敏感性為86%（20/23）和91%（2

27、1/23），相對特異性為100%（20/20），符合率為93%（40/43）和95%（41/43）. </p><p><b>　　3 討論 </b></p><p>　　在檢測抗HFRS抗體中以ELISA應(yīng)用最為普遍.目前測定中所用的抗原有2種:①HFRS病毒裂解物，它的抗原譜廣泛，但含有宿主細(xì)胞成份，因此易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，而且此類抗原具有一定的傳染性.②用基因重組

28、技術(shù)產(chǎn)生的病毒特異性抗原，這種抗原目前常用大腸桿菌來制備或噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)來制備，因此難免會(huì)帶有雜蛋白而產(chǎn)生假陽性結(jié)果，且重組多肽分子量大，有不少非特異性結(jié)構(gòu)，可能會(huì)與其它病毒的抗體交叉反應(yīng)［18］ .用人工合成的多肽抗原，這種抗原沒有細(xì)胞和細(xì)菌蛋白的混雜，而且分子量小，結(jié)構(gòu)簡單，可將幾個(gè)片段重合使用，有較高的特異性和敏感性，從而避免了與其它病毒、細(xì)菌抗體交叉反應(yīng)的可能［19］ .HFRS抗體的測定，可作為判斷HFRS感染的標(biāo)志，已成

29、為基層實(shí)驗(yàn)室診斷HFRS感染的主要方法.ELISA本身的優(yōu)越性和HFRS多肽抗原的特異性使本方法更具特色.它的結(jié)果可由儀器客觀記錄，也可采用目測法判斷（在測定最后每孔不加硫酸終止反應(yīng)），以待測樣品孔顏色明顯深于陰性對照孔為陽性.由于采用96孔聚苯乙烯板作為固相載體，既可一次處理許多標(biāo)本，也可多次分割使用，為操作者帶來了方便［20］ .白雪帆等［16，17］ 用</p><p><b>　　參考文獻(xiàn): &

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