支氣管哮喘病人T細胞及其亞群自噬觀察.pdf

1、成熟T淋巴細胞根據(jù)表面標志分為CD4<'+>和CD8<'+>T淋巴細胞。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，CD4<'+>T淋巴細胞在哮喘病人中可使多種白細胞自血液募集至氣道，并引起嗜酸粒細胞、肥大細胞和淋巴細胞的炎癥介質(zhì)釋放。且近期的實驗已從細胞水平證實哮喘中Th1/Th2失衡的存在，認為哮喘是一種免疫失衡性疾病，其Th2型免疫反應(yīng)異常增強，而Th1型免疫反應(yīng)卻異常減弱，并伴隨一系列的細胞因子的產(chǎn)生異常及氣道內(nèi)變態(tài)反應(yīng)性炎癥的發(fā)生。而Th1、Th2細胞正是由

2、CD4<'+>T淋巴細胞繼續(xù)分化而成。因此，誘導(dǎo)CD4<'+>T淋巴細胞無反應(yīng)性或凋亡成為支氣管哮喘預(yù)防和治療的方向之一。 另外，在大鼠模型中已證實，MHC Ⅰ類分子限制性的Tc1和Tc0細胞克隆在體內(nèi)可抑制IgE的產(chǎn)生，提示Tc亞群也參與調(diào)節(jié)傳統(tǒng)上認為由Th2介導(dǎo)的過敏反應(yīng)。目前對哮喘尤其是慢性哮喘的發(fā)生機制提出了T細胞假說：患者體內(nèi)存在著針對某些變應(yīng)原或病毒性抗原的記憶T細胞，當機體接觸過敏原或受病毒感染后，變應(yīng)原或病毒性抗

3、原循環(huán)至肺部，再次刺激肺部的特異性記憶T細胞，從而誘發(fā)持續(xù)的哮喘。一般認為，變應(yīng)原誘導(dǎo)Th細胞反應(yīng)，而病毒誘導(dǎo)Tc細胞反應(yīng)，均能招引和激活嗜酸性粒細胞并引起隨后的粘膜損傷，誘發(fā)IgE的產(chǎn)生，引起嗜酸性脫屑性支氣管炎、粘液分泌過度、血管平滑肌收縮。故通過應(yīng)用細胞因子或細胞因子抗體使Trh/Tc細胞的分化向Th1、Tc1漂移，可能為防治本病提供新的策略。 細胞凋亡是目前被普遍公認的一種程序性細胞死亡，但程序性細胞死亡并不僅僅是細胞

4、調(diào)亡一種，自噬亦屬其中一種方式。凋亡可由細胞內(nèi)特殊基因程序啟動而引起細胞死亡，多為自然發(fā)生，但也可由一些生理性或毒性因子誘發(fā)。自噬稱為Ⅱ型程序性細胞死亡，是真核細胞中廣泛存在的降解/再循環(huán)系統(tǒng)。自噬在氨基酸和激素等因素的調(diào)控下對蛋白質(zhì)等大分子和細胞器進行降解，降解產(chǎn)物可作為新合成蛋白質(zhì)和細胞器的原料。目前認為自噬與凋亡在宏觀與微觀的不同層次相互作用以有機地輔助機體完成生命活動的精細調(diào)控。因此，自噬與凋亡之間可能存在網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)通路。某些情

5、況下，自噬可保護細胞免于凋亡和壞死的危險。在各種因素(如氧化、TNF-α、FasL、鈣超載等)的刺激下，線粒體滲透性轉(zhuǎn)運通道開放，線粒體腫脹，釋放cyc-c等凋亡因子。此時，細胞啟動自噬來清除受損線粒體，避免凋亡因子釋放進入胞漿，從而對細胞起到一定保護作用。 研究發(fā)現(xiàn)，在許多疾病中可見到凋亡與自噬并存的現(xiàn)象，如亨廷頓病、震顫性麻痹和精神分裂癥等。在形態(tài)學(xué)方面的研究中也發(fā)現(xiàn)，當細胞受到凋亡刺激時，可見到細胞內(nèi)的自噬功能增強。在TG

6、F-1誘導(dǎo)的牛多核表皮細胞死亡中，凋亡和自噬典型形態(tài)學(xué)特征甚至出現(xiàn)于同一個細胞。這些研究均表明自噬與凋亡之間存在內(nèi)在聯(lián)系。 另外，由于PI3K(磷脂酰肌醇3激酶)可出現(xiàn)于自噬通路中，卻又能被在凋亡中起重要執(zhí)行作用的caspase-3所降解，令我們對caspase-3在自噬中的作用倍感興趣。所以，我們在實驗中同時檢測caspase-3的變化，以進一步了解其在自噬中的作用?？紤]到活化后的caspase-3常是凋亡終末期的標志，我們希

7、望能檢測到更早時期的caspase-3變化，遂將caspase-3酶原作為檢測目標。 所以，本實驗擬通過觀察支氣管哮喘病人T淋巴細胞及其亞群的白噬現(xiàn)象以進一步認識在T淋巴細胞及其亞群中存在的程序性細胞死亡方式，并對自噬與凋亡及caspase-3的關(guān)系進行初步探討。且因目前尚無糖皮質(zhì)激素對哮喘病人T淋巴細胞自噬作用的報道，我們亦將對糖皮質(zhì)激素在哮喘T淋巴細胞亞群中的自噬作用進行初步探討，為尋找新的治療措施提供方向。 第一部

8、分健康人T淋巴細胞及其亞群自噬誘導(dǎo)模型的建立。 一.方法 將經(jīng)密度梯度離心法、尼龍棉柱法和磁分離法分離所得的健康人T淋巴細胞及CD4<'+>、CD8<'+>T淋巴細胞，分地塞米松(DXM)、長春新堿(VCR)及空白(blank)組培養(yǎng)24<'->96h后觀察細胞光鏡及電鏡形態(tài)學(xué)、MDC熒光染色，并用流式細胞儀檢測自噬和凋亡細胞比例、caspase-3比例變化。 二．結(jié)果 1.健康人外周血T淋巴細胞在無誘導(dǎo)

9、劑條件下，或經(jīng)VCR誘導(dǎo)均可出現(xiàn)典型自噬細胞形態(tài)學(xué)改變。 2.健康人外周血T淋巴細胞經(jīng)VCR誘導(dǎo)的自噬率與凋亡率有顯著相關(guān)性，p=0.041。 3.健康人外周血CD4<'+>、CD8<'+>T淋巴細胞自噬率與caspase-3比例無明顯相關(guān)性，p>0.05。 第二部分支氣管哮喘病人T淋巴細胞及其亞群自噬觀察。 一．方法 本實驗部分通過磁分離法分離、培養(yǎng)哮喘病人T淋巴細胞及CD4<'+>、CD8<'

10、+>T淋巴細胞，檢測72 h不同藥物組的細胞自噬率、凋亡率和caspase-3比例變化。 二.結(jié)果 1.哮喘病人CD4<'+>T淋巴細胞自噬現(xiàn)象的觀察 ①哮喘病人CD4<'+>T淋巴細胞自然培養(yǎng)狀態(tài)下，與健康對照組比較，自噬率無明顯差異，p>0.05。 ②哮喘病人CD4<'+>T淋巴細胞經(jīng)DXM誘導(dǎo)，與健康對照組比較，自噬率明顯升高，p=0.035。 ③哮喘病人CD4<'+>T淋巴細胞經(jīng)VCR誘

11、導(dǎo)，與健康對照組比較，自噬率明顯升高，p=0.047。 2.哮喘病人CD8<'+>T淋巴細胞自噬現(xiàn)象的觀察哮喘病人CD8<'+>T淋巴細胞無論經(jīng)DXM、VCR或自然培養(yǎng)條件下，自噬率與健康對照組比較均無明顯差異，p>0.05。 3.哮喘病人CD4<'+>T淋巴細胞凋亡現(xiàn)象的觀察 ①哮喘病人CD4<'+>T淋巴細胞自然培養(yǎng)狀態(tài)下，與健康對照組比較，凋亡率明顯下降，p=0.023。 ②哮喘病人CD4<'+>T

12、淋巴細胞經(jīng)DXM誘導(dǎo)，與健康對照組比較，凋亡率明顯下降，p=0.005。 ③哮喘病人CD4<'+>T淋巴細胞經(jīng)VCR誘導(dǎo)，與健康對照組比較，凋亡率明顯下降，p=0.012。 4.哮喘CD4<'+>T淋巴細胞caspase-3比例變化的觀察 ①哮喘病人CD4<'+>T淋巴細胞自然培養(yǎng)狀態(tài)下，與健康對照組比較，caspase-3比例明顯下降，p=0.004。 ②哮喘病人CD4<'+>T淋巴細胞經(jīng)DXM誘導(dǎo)，與

13、健康對照組比較，caspase-3比例明顯下降，p=0.031。 ③哮喘病人CD4<'+>T淋巴細胞經(jīng)VCR誘導(dǎo)，與健康對照組比較，caspase-3比例無明顯變化，p>0.05。 5.哮喘病人CD8<'+>T淋巴細胞凋亡現(xiàn)象的觀察 ①哮喘病人CD8<'+>T淋巴細胞自然培養(yǎng)狀態(tài)下，與健康對照組比較，凋亡率明顯升高，p=0.026。 ②哮喘病人CD8<'+>T淋巴細胞經(jīng)DxM誘導(dǎo)，與健康對照組比較，凋亡率

14、無明顯差異，p>0.05。 ⑧哮喘病人CD8<'+>T淋巴細胞經(jīng)VCR誘導(dǎo)，與健康對照組比較，凋亡率無明顯差異，p>0.05。 6.哮喘病ACD8<'+>T淋巴細胞caspase-3比例變化的觀察哮喘病人cD8<'+>T淋巴細胞自然培養(yǎng)狀態(tài)下，或經(jīng)DXM、VCRi誘導(dǎo)，與健康對照組比較，其caspase-3 比例均無明顯差異，p>0.05。 7.哮喘?。甼CD4<'+>T淋巴細胞自噬與凋亡現(xiàn)象的相關(guān)性分析

15、 ①哮喘病人CD4<'+>T淋巴細胞自噬率與凋亡率變化無明顯相關(guān)性，p>0.05。 ②哮喘病人CD4<'+>T淋巴細胞自噬率與caspase-3比例變化無明顯相關(guān)性，p>0.05。 8.哮喘病人CD8<'+>T淋巴細胞自噬與凋亡現(xiàn)象的相關(guān)性分析 ①哮喘病人ACD8<'+>T淋巴細胞自噬率與凋亡率變化無明顯相關(guān)性，p>0.05。 ②哮喘病人CD8<'+>T淋巴細胞自噬率與caspase-3比例變化無明顯相