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文檔簡介
1、[目的]
本實驗將嘗試以天冬氨酸六肽為丹參素的骨靶向載體,設計并合成可能具有骨靶向性的化合物天冬氨酸六肽-丹參素(DD6),并初步研究其藥理學效應。
[方法]
1.天冬氨酸六肽-丹參素(DD6)的合成實驗本文采用Fmoc固相合成法合成丹參素-天冬氨酸六肽(DD6),固相載體選擇Wang樹脂,采用手工合成裝置,室溫下氮氣鼓吹保護及攪拌。合成分三部分進行:Fmoc-Asp(OtBu)-O-Wang樹
2、脂的合成,F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-[Asp(OtBu)]4-Asp(OtBu)-O-Wang樹脂的合成,DD6的合成。粗品經(jīng)HPLC分離純化后冷凍干燥。結合HPLC、ESI-MS和1H-NMR對化合物進行鑒定。
2.DD6的親骨性研究實驗以羥基磷灰石(HA)作為實驗模型體外初探DD6的骨靶向性,分別觀察HA對DD6及丹參素(DSU)的吸附特點,并比較它們對HA的親和力強弱,以此說明DD6的親骨性強弱?;衔飳A的親
3、和力用吸附率及吸附量來表示,應用HPLC測定吸附前后DD6或DSU的濃度。
3.DD6對成骨細胞增殖的影響及對骨髓基質干細胞(MSCs)成骨分化的影響采用新生大鼠顱蓋骨成骨細胞(rOB)體外培養(yǎng)給藥,觀察DD6和DSU不同濃度和不同時間對rOB增殖的影響,判斷DD6是否具有促成骨細胞增殖作用,同時判斷DSU結合載體后增殖能力是否變化;體外培養(yǎng)骨髓基質干細胞(MSCs),直接給藥觀察DD6及DSU對細胞堿性磷酸酶活性的影響,
4、判斷DD6對骨髓基質干細胞成骨分化的影響。
[結果]
最終得100mg凍干品,純度約為91.0%。第一個氨基的導入率可達98.6%,其余氨基酸的縮合率可達97.8%,六肽樹脂與丹參素的縮合率為53.3%,純化回收率為14.1%。結合HPLC、ESI-MS、1H-NMR結果驗證其主要成份為DD6。
羥基磷灰石吸附實驗顯示HA對DD6的吸附率隨著DD6濃度的升高而逐漸下降,而其吸附量隨著DD6濃度的
5、升高而升高,當DD6達到一定濃度時其吸附量趨于平衡;HA對DD6吸附率及吸附量隨著HA量的增加而升高。HA對DD6的吸附量約是DSU的60倍。
DD6(2.5×10-7~2.5×10-6M)可促進rOB增殖作用,作用在24h-48h增殖明顯。DSU(5.0×10-7M和2.5×10-6M)作用48 h增殖高峰。DD6促增殖能力有強于DSU的趨勢。
DD6可誘導rMSCs成骨分化分泌ALP,濃度為5.0×10-
6、6M時作用最強,第21天仍有誘導作用。在實驗時間內(nèi),DD6隨著作用時間的延長誘導作用逐漸增強,作用有較DSU持久的趨勢。
[結論]
采用本實驗合成方案可成功合成DD6,從第一個氨基酸與樹脂的連接反應開始,總合成率為6.6%。
DD6具有骨靶向性,親骨性強于DSU;六肽載體使得DSU的親骨性得以提高,預示DSU在骨組織中的分布將會增多。
DD6的體外藥效研究證明其具有促成骨細胞增殖及
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