肝硬化大鼠中縫背核5-HT及NOS陽(yáng)性神經(jīng)元的改變.pdf

1、肝硬化晚期常因中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的功能調(diào)節(jié)紊亂，引起肝性腦病的發(fā)生。肝硬化門(mén)靜脈高壓與門(mén)靜脈系統(tǒng)血流受阻及內(nèi)臟血流高動(dòng)力循環(huán)有關(guān)，導(dǎo)致了血液許多活性物質(zhì)的代謝失調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)肝硬化外周血液循環(huán)一氧化氮(nitric oxide，NO)的含量明顯高于正常水平，暗示NO可能參與了肝性腦病的病理生理，因而受到越來(lái)越多的重視。5-HT是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)系統(tǒng)分布廣泛，對(duì)機(jī)體的心理、行為及情緒等有著重要的調(diào)節(jié)作用。近年的研究發(fā)現(xiàn)

2、肝硬化患者血液循環(huán)5-HT明顯增多，推測(cè)5-HT參與了肝性腦病的發(fā)生。
　　 以往的研究表明，中縫背核除5-HT能神經(jīng)元外，還存在較多的NOS陽(yáng)性神經(jīng)元。肝硬化后中縫背核5-HT及NOS陽(yáng)性神經(jīng)元是否受到累及目前尚不十分清楚。
　　 因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)皮下注射四氯化碳油溶劑建立肝硬化大鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型；利用免疫組織化學(xué)、NADPH-d組織化學(xué)及NADPH-d復(fù)合免疫組織化學(xué)的方法，觀察肝硬化大鼠中縫背核5-HT能神經(jīng)元及NO

3、S陽(yáng)性神經(jīng)元的形態(tài)及表達(dá)的改變，為二者可能參與肝硬化導(dǎo)致的肝性腦病提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的：觀察肝硬化大鼠中縫背核5-HT及NOS的表達(dá)改變，推測(cè)其在肝硬化所致肝性腦病發(fā)病中的作用。
　　 方法：選用成年雄性Wistar大鼠30只，體重150-200g，隨機(jī)抽出10只為正常對(duì)照組，剩余動(dòng)物20只為實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組給予60％CC14溶液皮下注射結(jié)合5％乙醇自來(lái)水溶液飲用。首次每只大鼠0.5ml/100g，以后每只0.

4、3ml/100g，每周注射2次，共14周；對(duì)照組每周背部皮下注射生理鹽水，自來(lái)水飲用，其余同模型組。肝組織HE染色，確定肝硬化的形成；以免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察中縫背核5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元的變化、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-黃遞酶(NADPH-d)染色觀察中縫背核NOS陽(yáng)性神經(jīng)元的變化，并對(duì)中縫背核行NADPH-d染色復(fù)合5-HT免疫細(xì)胞化學(xué)染色。應(yīng)用IPP6.0圖像分析系統(tǒng)分析對(duì)照組和肝硬化組大鼠的5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元、NADPH-

5、d陽(yáng)性神經(jīng)元的神經(jīng)元數(shù)目及細(xì)胞平均直徑和平均光密度值；應(yīng)用奧林巴斯顯微鏡于40倍物鏡下計(jì)數(shù)1cm2范圍的中縫背核NADPH-d復(fù)合5-HT免疫細(xì)胞化學(xué)的雙標(biāo)神經(jīng)元數(shù)目。
　　 結(jié)果：
　　 1.HE染色結(jié)果：對(duì)照大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝板條索狀以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細(xì)胞無(wú)變性、壞死；肝硬化大鼠肝細(xì)胞溶解，彌漫性大片壞死，殘留肝細(xì)胞成片氣球樣變；肝細(xì)胞呈小灶狀壞死明顯多于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

6、
　　 2.免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果：對(duì)照組大鼠腦內(nèi)5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元主要集中在中腦下丘階段，從低倍鏡下觀察可見(jiàn)位于中腦水管腹側(cè)與兩側(cè)內(nèi)側(cè)縱束之間的多細(xì)胞聚集區(qū)；位于中央管腹側(cè)的中縫背核5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元整體形態(tài)呈噴泉樣；與對(duì)照組大鼠相比，肝硬化大鼠中縫背核5-HT免疫反應(yīng)神經(jīng)元在分布上未見(jiàn)顯著區(qū)別，但免疫反應(yīng)強(qiáng)度明顯高與對(duì)照組大鼠。(1)肝硬化大鼠中縫背核5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量：正常對(duì)照組大鼠中縫背核5-

7、HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量為104.04±25.99；肝硬化組中縫背核5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量為101.46±24.18。與對(duì)照組相比，無(wú)顯著性意義（P＞0.05）。(2)肝硬化大鼠中縫背核5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元的直徑：正常對(duì)照組大鼠中縫背核5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元的直徑為10.471±0.62;肝硬化組中縫背核5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元的直徑為9.759±0.44。與對(duì)照組相比，肝硬化組5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元的直徑

8、明顯變小，比對(duì)照組降低了6.80％，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。(3)肝硬化大鼠中縫背核5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元的平均光密度：正常對(duì)照組中縫背核5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元平均光密度值為0.477±0.040；肝硬化組中縫背核5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元平均光密度值為0.528±0.041。與對(duì)照組相比，肝硬化組大鼠中縫背核5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元免疫反應(yīng)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，比對(duì)照組增加了10.70％，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

9、　　 3.NADP-d染色結(jié)果：對(duì)照組大鼠中縫背核多數(shù)NOS陽(yáng)性神經(jīng)元為藍(lán)色深染；NOS陽(yáng)性神經(jīng)元及纖維散在分布于中縫核各部分，中縫背核較為密集，尤其是中縫背核背側(cè)和腹側(cè)神經(jīng)元數(shù)量較多。與對(duì)照組相比，肝硬化組大鼠中縫背核NOS神經(jīng)元染色明顯變淺。(1)肝硬化大鼠中縫背核NOS陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量：正常對(duì)照組大鼠中縫背核NOS神經(jīng)元的數(shù)量為47.88±6.17；肝硬化組中縫背核NOS神經(jīng)元的數(shù)量為28.50±4.00。與正常對(duì)照組相比，肝硬

10、化大鼠中縫背核NOS陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，比正常對(duì)照組降低了40.48％，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。(2)肝硬化大鼠中縫背核NOS陽(yáng)性神經(jīng)元的大小：正常對(duì)照組大鼠中縫背核NOS陽(yáng)性神經(jīng)元平均直徑為12.42±1.89;肝硬化組中縫背核NOS陽(yáng)性神經(jīng)元平均直徑為10.72±0.41。與正常對(duì)照組相比，肝硬化大鼠中縫背核NOS神經(jīng)元直徑顯著減少，比正常對(duì)照組降低了13.67％，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。(3)肝硬化大鼠中縫背核NO

11、S能神經(jīng)元的光密度值：正常對(duì)照組中縫背核NOS陽(yáng)性神經(jīng)元平均光密度值為0.042±0.010；肝硬化組中縫背核NOS陽(yáng)性神經(jīng)元平均光密度值為0.014±0.002。與對(duì)照組相比，肝硬化組中縫背核NOS陽(yáng)性神經(jīng)元免疫反應(yīng)強(qiáng)度明顯降低，比對(duì)照組降低了66.670％，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 4.NADPH-d染色復(fù)合5-HT免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果：在中縫背核NADPH-d染色復(fù)合5-HT免疫細(xì)胞化學(xué)的切片，NOS復(fù)合5-HT免

12、疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元主要集中在中縫背核背側(cè)部和中縫背核腹側(cè)部。這兩個(gè)中縫背核亞核團(tuán)中的5-HT陽(yáng)性神經(jīng)元中僅部分5-HT能免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元為NOS陽(yáng)性。對(duì)照組中縫背核背側(cè)部雙標(biāo)細(xì)胞平均數(shù)量為8.00±5.20，占5-HT能神經(jīng)元的50％;中縫背核腹側(cè)部雙標(biāo)細(xì)胞平均數(shù)量為32.33±16.01，占5-HT能神經(jīng)元的60.62％;與之相比，肝硬化組中縫背核背側(cè)部雙標(biāo)細(xì)胞平均數(shù)量為8.75±2.06，占5-HT能神經(jīng)元的53.03％;中縫背核腹