中縫背核5-HT神經(jīng)元在orexin促麻醉覺(jué)醒中的作用.pdf

1、背景：全身麻醉至今已經(jīng)有170年的歷史，但是其作用機(jī)制還不完全清楚，目前越來(lái)越多的學(xué)者傾向于用網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制解釋麻醉藥物的作用，認(rèn)為腦內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)質(zhì)及其投射系統(tǒng)與全身麻醉的產(chǎn)生和調(diào)控相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)小組前期系列研究已經(jīng)證明神經(jīng)肽orexin在全麻覺(jué)醒中發(fā)揮重要作用，發(fā)現(xiàn)orexin可以激活結(jié)節(jié)乳頭核的組胺能神經(jīng)元和多巴胺、腎上腺素能神經(jīng)元發(fā)揮其促麻醉覺(jué)醒的作用。有研究表明oreixn亦可以作用于激活腦干中縫背核（dorsal raphe

2、 nucleus，DRN）的5-羥色胺能（5-hydroxytryptamine,5-HT）神經(jīng)元，調(diào)控如睡眠等生理功能。5-HT是一種在生物體內(nèi)廣泛存在的單胺類(lèi)物質(zhì)，參與痛覺(jué)、體溫、情緒、睡眠-覺(jué)醒的調(diào)控，已有證據(jù)表明5-HT在麻醉中也有作用。本文旨在探討異氟烷麻醉中 DRN的5-HT能神經(jīng)元是否參與介導(dǎo)orexin神經(jīng)元麻醉促覺(jué)醒作用。
　　目的：了解腦干的DRN區(qū)的5-HT能神經(jīng)元在orexin異氟烷促麻醉覺(jué)醒效應(yīng)中的作用和

3、機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)一： DRN區(qū)微注射orexin及其受體配體對(duì)異氟烷麻醉的誘導(dǎo)和覺(jué)醒時(shí)間的影響
　　方法：成年雄性SD大鼠（體重230-300g），月齡3-4m，實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物先在10％水合氯醛麻醉下（1ml/kg，i.p.）。（1）在DRN埋置核團(tuán)微注射外套管，5-7天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。大鼠在氧流量為1.5L/min、異氟烷濃度為1MAC（1.4%）條件下進(jìn)行麻醉。麻醉第15分鐘時(shí) DRN區(qū)微注射 orexin-A（30pmol/0

4、.3ul,100pmol/0.3ul）或 orexin-B（30pmol/0.3ul,100pmol/0.3ul），對(duì)照組注射 saline（0.3ul），另外兩組微注射 orexinⅠ型受體拮抗劑 SB334867（5ug/0.3ul,20ug/0.3ul）或Ⅱ型受體拮抗劑 TCS-OX2-29（5ug/0.3ul,20ug/0.3ul），對(duì)照組給予 DMSO（0.3ul）。給藥15分鐘后停止麻醉劑吸入，給藥終止至大鼠翻正反射恢復(fù)時(shí)間

5、為覺(jué)醒時(shí)間（emergence time）。觀察記錄SD雄性大鼠異氟烷麻醉的覺(jué)醒時(shí)間。
　?。?）慢誘導(dǎo)法觀察麻醉誘導(dǎo)時(shí)間：動(dòng)物分組同上。上述各種試劑于給藥后15分鐘進(jìn)行麻醉。將大鼠置入麻醉箱，氧流量設(shè)為1.5L/min，異氟烷揮發(fā)罐濃度為2%。從麻醉劑開(kāi)始吸入至大鼠翻正反射消失時(shí)間為麻醉誘導(dǎo)時(shí)間（nduction time），記錄慢誘導(dǎo)的誘導(dǎo)時(shí)間。
　　結(jié)果：（1）與saline對(duì)照組比較（13.91±0.90min），D

6、RN區(qū)微注射100pmol（10.05±0.36min）和30pmol（11.6±0.36min） orexin-A后大鼠的覺(jué)醒時(shí)間均顯著縮短（p<0.05）。DRN區(qū)微注射100pmol orexin-B也有促麻醉覺(jué)醒作用（10.59±0.40 min），與對(duì)照組相比覺(jué)醒時(shí)間縮短（p<0.05），但30pmol組的覺(jué)醒時(shí)間（11.78±0.56 min）與對(duì)照組相比無(wú)明顯差別（p>0.05）。微注射orexinⅠ型受體拮抗劑SB334

7、86720ug后覺(jué)醒時(shí)間（13.81±0.18 min）比DMSO對(duì)照組（11.33±0.35 min）延長(zhǎng)（p<0.05），但5ug組無(wú)此作用（11.84±0.46 min，p>0.05 vs對(duì)照組）。給予 orexinⅡ型受體拮抗劑TCS-OX2-29后（18.07±0.67 min）也對(duì)覺(jué)醒時(shí)間無(wú)影響（p>0.05）。
　?。?）在慢誘導(dǎo)，orexin-A（30pmol/0.3ul,100pmol/0.3ul）、orexin

8、-B（30pmol/0.3ul,100pmol/0.3ul）、orexinⅠ型受體拮抗劑SB334867（5ug/0.3ul,20ug/0.3ul）和Ⅱ型受體拮抗劑TCS-OX2-29（5ug/0.3ul,20ug/0.3ul）的DRN核團(tuán)微注射都對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間都無(wú)影響（p>0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)二：DRN區(qū)微注射orexin及其受體配體對(duì)異氟烷麻醉誘導(dǎo)的腦電變化的影響
　　方法：成年雄性SD大鼠（體重230-300g），月齡3

9、-4m，實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物先在10%水合氯醛麻醉下（1ml/kg，i.p.）。（1）實(shí)驗(yàn)前于DRN核團(tuán)區(qū)進(jìn)行微注射外套管和腦電監(jiān)測(cè)電極的埋置。5-7天后在氧流量為1.5L/min，異氟烷濃度為1MAC（1.4%）條件下對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉。在麻醉第30分鐘時(shí)DRN區(qū)微注射orexin-A（100pmol/0.3ul）、orexin-B（100pmol/0.3ul），對(duì)照組給予saline（0.3ul）。觀察從麻醉前清醒狀態(tài)到異氟烷麻醉后的腦電變化以及

10、給藥的影響，計(jì)算爆發(fā)性抑制率的變化(Burst Surpression Ratio，BSR)，并和對(duì)照組進(jìn)行比較。
　?。?）DRN核團(tuán)微注射套管與腦電監(jiān)測(cè)電極埋置術(shù)，5-7天后在氧流量為1.5L/min，異氟烷濃度為0.75MAC（1%）條件下對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，在麻醉第30分鐘，DRN核團(tuán)微注射orexin-A（30pmol/0.3ul，100pmol/0.3ul），對(duì)照組給予saline（0.3ul）觀察和分析腦電頻譜變化。

11、r>　　結(jié)果：（1）與對(duì)照組相比（18.72±2.69%），DRN核團(tuán)微注射orexin-A后腦電的爆發(fā)性抑制率（BSR，9.55±1.54%）降低（p<0.05），腦電波向類(lèi)覺(jué)醒波轉(zhuǎn)變。
　　（2）與對(duì)照組相比，DRN區(qū)微注射100pmol orexin-A后EEGδ波明顯減少，而30pmol orexin-A注射組δ波僅輕微減少。
　　實(shí)驗(yàn)三：orexin對(duì)麻醉過(guò)程中DRN區(qū)5-HT神經(jīng)元活性的影響
　　方法：成年

12、雄性SD大鼠（體重230-300g），月齡3-4m，實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物先在10%水合氯醛麻醉下（1ml/kg，i.p.）。側(cè)腦室微注射外套管埋置術(shù)，5-7天后在氧流量為1.5L/min，異氟烷濃度為1MAC（1.4%）情況下對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，麻醉第15分鐘側(cè)腦室微注射orexin-A（100pmol/0.3ul）或saline（0.3ul）麻醉第30分鐘處死，對(duì)照組大鼠清醒狀況下心臟注射10%氯化鉀處死，處死后灌注取材免疫熒光法標(biāo)記5-HT神經(jīng)元

13、的活動(dòng)狀態(tài)，采用5-HT與c-Fos共標(biāo)記確定5-HT神經(jīng)元的活動(dòng)狀態(tài)，觀察5-HT神經(jīng)元活化情況。
　　結(jié)果：用c-Fos表達(dá)細(xì)胞數(shù)量百分比表示5-HT神經(jīng)元活化率，側(cè)腦室微注射orexin-A組（12.54±1.45%）高于微注射saline組（7.20±0.78%p<0.05），與未給予麻醉處死組（13.24±1.64%）相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，orexin可以通過(guò)促進(jìn)中縫背核的5-HT能神經(jīng)元