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1、一、研究背景 長(zhǎng)期以來,臨床上的骨缺損修復(fù),特別是大段骨缺損的修復(fù),一直是外科醫(yī)生面臨的難題之一。用于骨缺損修復(fù)的材料主要有自體骨、同種異體骨及人工骨三類。其中同種異體骨由于其成骨性能及力學(xué)性能優(yōu)于人工骨,而來源也不像自體骨那樣受到限制,因而成為臨床上應(yīng)用最為廣泛的骨修復(fù)材料。 同種異體骨的臨床應(yīng)用一直受到其免疫原性及疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)的制約。早些時(shí)候人們?cè)鴩L試著用柳硫汞等化學(xué)方法的處理來降低異體骨的免疫原性和對(duì)其進(jìn)行滅菌,但
2、效果不佳。隨著制備工藝的改進(jìn),人們逐漸傾向于用深低溫冷凍法、冷凍干燥法及γ射線輻照來降低異體骨的免疫原性,其中γ射線輻照更兼具強(qiáng)大的滅菌功效。經(jīng)過世界各國(guó)骨庫(kù)幾十年來的實(shí)踐證明,上述方法能夠很好地降低異體骨的免疫原性并有效地降低了因骨移植所致的疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn),因而是目前最為常用的同種異體骨的制備方法。 然而嚴(yán)格地講,上述方法并不能完全消除同種異體骨的免疫原性,而經(jīng)過上述方法處理后,同種異體骨的成骨性能及生物力學(xué)性能受到了明顯的損
3、害。致使目前為止臨床上應(yīng)用異體骨修復(fù)骨缺損的效果,特別是修復(fù)大段骨缺損的效果仍不能夠令人滿意。 鑒于此,我們與許多研究者一樣,希望對(duì)同種異體骨的制備方法進(jìn)行新的探索。具體而言,就是在制備同種異體骨的過程中復(fù)合環(huán)孢菌素,通過在局部發(fā)揮環(huán)孢菌素強(qiáng)大的免疫抑制作用來代替深低溫冷凍、冷凍干燥及Y射線輻照的降免疫原性作用,并用低溫等離子體技術(shù)來代替γ射線輻照對(duì)異體骨進(jìn)行滅菌,以期更好地抑制異體骨移植的免疫排斥反應(yīng),同時(shí)減輕制備過程中對(duì)異體
4、骨成骨性能及力學(xué)性能的損害。另外,我們希望通過環(huán)孢菌素的局部應(yīng)用來降低其藥物副反應(yīng)。 二、研究目的 初步驗(yàn)證復(fù)合環(huán)孢菌素并等離子體滅菌這一新的異體骨制備方法與深低溫冷凍、冷凍干燥及γ射線輻照等方法相比,在抑制免疫排斥,促進(jìn)骨愈合以及降低力學(xué)性能損害等方面的可行性甚至優(yōu)越性。同時(shí)初步驗(yàn)證該方法的安全性。 三、實(shí)驗(yàn)方法 將新西蘭兔分為實(shí)驗(yàn)、對(duì)照及空白三組并制備兔橈骨中段段缺損模型。實(shí)驗(yàn)組植入復(fù)合環(huán)孢菌素的同種
5、異體骨,對(duì)照組植入深低溫冷凍/冷凍干燥輻照異體骨,空白組曠置。并分別在不同時(shí)間點(diǎn)于各組之間進(jìn)行免疫學(xué)評(píng)價(jià)(包括手術(shù)局部狀況的比較,外周血淋巴細(xì)胞亞群分析及CD<,25>分子密度的比較),成骨性能評(píng)價(jià)(包括X線評(píng)分及組織學(xué)量化分析),以及生物力學(xué)評(píng)價(jià)(四點(diǎn)彎曲試驗(yàn))。為了初步驗(yàn)證新方法的安全性,我們進(jìn)行了體外細(xì)胞毒性及體內(nèi)藥物副反應(yīng)等方面的比較。 四、主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (一)免疫學(xué)評(píng)價(jià)1.手術(shù)局部狀況的比較材料植入術(shù)后實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照
6、組動(dòng)物的手術(shù)切口均一期愈合,傷口局部無(wú)紅腫、滲液及化膿等情況出現(xiàn)。 2.外周血淋巴細(xì)胞亞群分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組CD<,4><'+>T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)在不同時(shí)間點(diǎn)之間有顯著性差異(F=11.980,P<0.001);實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)之間無(wú)顯著性差異(F=2.941,P=0.067),而對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)之間差異顯著(F=23.425,P<0.001)。對(duì)照組在術(shù)后1周及4周持續(xù)下降,而到了術(shù)后16周卻顯著反彈達(dá)到峰值。兩組CD<,4><'+
7、>T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)無(wú)顯著性差異(F=13.984.,P=0.345);從各時(shí)間點(diǎn)看,術(shù)前1天及術(shù)后1周兩組無(wú)顯著性差異,P值分別為0.248及0.702,術(shù)后4周實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組(t=6.906,P<0.001),術(shù)后16周對(duì)照組顯著高于實(shí)驗(yàn)組(t=-3.583,P=0.003)。 3.CD<,25>分子密度的比較對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組骨缺損局部行CD<,25>分子免疫組化染色可見,術(shù)后1周及4周兩組局部陽(yáng)性物質(zhì)密度大體相當(dāng),而術(shù)
8、后16周,對(duì)照組局部的陽(yáng)性物質(zhì)密度明顯高于實(shí)驗(yàn)組。 (二)成骨性能評(píng)價(jià) 1.X線評(píng)分實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)的X線評(píng)分結(jié)果之間有顯著性差異(F=386.159,P<0.001);在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均如此,F(xiàn)值分別為211.000和175.689,均為P<0.001。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在術(shù)后1周分值最低,然后在后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均呈上升趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)組分值顯著高于對(duì)照組(F=5.671,P=0.032);從各時(shí)間點(diǎn)看,術(shù)后1周和術(shù)后4周兩組無(wú)
9、顯著性差異(P值分別為0.4175和0.052),而在術(shù)后16周,實(shí)驗(yàn)組評(píng)分顯著高于對(duì)照組(t=4.056,P=0.001)。2.組織學(xué)評(píng)價(jià)及量化分析術(shù)后1周對(duì)照組植入材料內(nèi)有大量的有核細(xì)胞浸潤(rùn),仍可見大量壞死物質(zhì)及殘存的骨小梁。實(shí)驗(yàn)組可見大量的新骨或類骨樣物質(zhì)生成,而材料內(nèi)仍有大量的壞死物質(zhì)未被清除。 術(shù)后4周實(shí)驗(yàn)組植骨材料內(nèi)新骨生成的范圍明顯大于對(duì)照組,壞死組織也明顯減少,但正常骨組織的板層狀結(jié)構(gòu)并不明顯。 術(shù)后16
10、周對(duì)照組植入材料內(nèi)已有大量的新骨生成,骨陷窩明顯可見,細(xì)胞團(tuán)塊中可見脂滴形成,提示有部分髓腔再通,周圍的壞死物質(zhì)也已被基本清除,但新生骨并未形成成片的板層狀結(jié)構(gòu),骨組織內(nèi)僅有少量血管。實(shí)驗(yàn)組植入材料內(nèi)可見成片的板層狀骨,且大部分骨質(zhì)已成熟,可見大量的血管生成及骨陷窩,周圍無(wú)壞死物質(zhì)殘留,髓腔內(nèi)細(xì)胞團(tuán)塊中有脂滴形成,提示髓腔再通。 (三)生物力學(xué)評(píng)價(jià)四點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果提示,實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本的極限彎曲負(fù)荷顯著高于對(duì)照組(t=2.257,P=0.
11、048)。 (四)安全性評(píng)價(jià)1.體外細(xì)胞毒性培養(yǎng)7天后光鏡下可見骨髓間充質(zhì)細(xì)胞在材料周圍生長(zhǎng)旺盛,形態(tài)良好;掃描電鏡下可見細(xì)胞伸展良好,與材料表面貼附緊密。細(xì)胞表面大量的分泌顆粒提示細(xì)胞的分泌功能旺盛。 各濃度組骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的OD值在不同時(shí)間點(diǎn)之間有顯著性差異(F=21.714,P=0.001);除了濃度Ⅵ組(F=1.080,P=0.417)外,其余各組均如此(濃度Ⅰ組:F=21.808,P<0.001;濃度Ⅱ組:F=7.
12、057,P=0.006;濃度Ⅲ組:F=10.109,P=0.002;濃度Ⅳ組:F=14.262,P<0.001;濃度V組:F=87.650,P<0.001;空白對(duì)照組:F=419.880,P<0.001;75%乙醇對(duì)照組:F=1157.776,P<0.001)。不同濃度組的OD值之間具有顯著性差異(F=278.126,P<0.001);從各時(shí)間點(diǎn)看,除了培養(yǎng)第1天(F=1.595,P=0.207)外,其余各時(shí)間點(diǎn)上不同濃度組之間的OD值
13、均有顯著性差異(第3天:F=27.558,P<0.001;第5天:F=177.827,P<0.001;第7天:F=24.401,P<0.001;第9天: F=6.961,P=0.001)。從不同濃度環(huán)孢菌素下骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線可見,局部添加的高濃度環(huán)孢菌素對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用??傮w而言,隨著環(huán)孢菌素藥物濃度的增加,對(duì)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的抑制作用就越明顯。然而最高濃度組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(5mg/ml組),既不同于低濃度組(
14、空白對(duì)照組,乙醇對(duì)照組,0.05μg/ml組及0.5μg/ml),也不同于較高濃度組(5μg/ml組,50μg/ml組及500μg/ml組)。該曲線所反映的細(xì)胞增殖趨勢(shì)介于上述兩組之間。濃度Ⅵ組在不同時(shí)間點(diǎn)與其它各組比較的P值在一定程度上也支持這樣一個(gè)結(jié)果。在細(xì)胞培養(yǎng)的第3天,除與濃度Ⅱ組比較外(P=0.063),與其它各組比較的P值均<0.05;而在第5、7天,濃度Ⅵ組與其它各組比較的P值均<0.05。 2.體內(nèi)藥物副反應(yīng)各組
15、動(dòng)物在整個(gè)觀察期間均未見明顯的躁動(dòng)、震顫、嘔吐、腹瀉及齒齦增生等癥狀或體征。 術(shù)后7天,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組動(dòng)物的肝臟與腎臟經(jīng)組織學(xué)證明均為正常組織,兩組的組織學(xué)表現(xiàn)無(wú)明顯差異。 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的濃度在不同時(shí)間點(diǎn)之間無(wú)顯著性差異(F=3.019,P=0.057);在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均如此,F(xiàn)值分別為1.907和1.179,P值分別為0.199和0.371。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(F=0.025,P=0.880)
16、;從各時(shí)間點(diǎn)看,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異(P值分別為0.808,0.721,0.608和0.913)。 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組血清肌酐的濃度在不同時(shí)間點(diǎn)之問有顯著性差異(F=7.092,P=0.002);實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)的濃度之問無(wú)顯著性差異(F=6.305,P=0.083),對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)的濃度之間亦無(wú)顯著性差異(F=1.740,P=0.228)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(F=0.117,P=0.744);從各時(shí)間點(diǎn)看,實(shí)
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