同種異體骨復(fù)合纖維蛋白多聚體作為利福平緩釋載體的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的： 世界上約1/3人口感染過結(jié)核桿菌，2007年全球估計(jì)有1300萬結(jié)核病患者，而中國結(jié)核病患者約占17％，僅次于印度。日益嚴(yán)峻的結(jié)核耐藥形勢危機(jī)社會公共衛(wèi)生安全，目前學(xué)術(shù)界、政府機(jī)構(gòu)關(guān)注焦點(diǎn)集中于肺結(jié)核，骨關(guān)節(jié)結(jié)核耐藥所占比例小，沒有獲得足夠的關(guān)注。骨關(guān)節(jié)結(jié)核雖然比例小，但基于中國結(jié)核病負(fù)擔(dān)重、人口基數(shù)大，骨關(guān)節(jié)結(jié)核將越來越常見，應(yīng)引起骨科醫(yī)師的重視。自1963年發(fā)明利福平用于抗結(jié)核治療以來，大大縮短了結(jié)核病療程，成

2、為聯(lián)合化療的基石。但系列研究表明利福平口服生物利用度差，血漿中藥物濃度較低。脊柱結(jié)核病理特殊，有膿液、干酪組織、死骨、硬化骨等病變，血供差，口服用藥難以保證病灶區(qū)內(nèi)足夠的藥物濃度。提高病灶內(nèi)藥物濃度可能增強(qiáng)其殺菌效果，為維持病灶內(nèi)有效藥物濃度，緩控釋制劑成為研究焦點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)主要目的包括(1)篩選一種抗結(jié)核藥物用于脊柱結(jié)核局部緩釋；(2)冷凍干燥同種異體骨復(fù)合纖維蛋白多聚體作為抗結(jié)核藥物緩釋載體，制備一種新型植入型緩釋系統(tǒng)；(3)體

3、內(nèi)外評價(jià)植入型抗結(jié)核藥物緩釋系統(tǒng)的特性。 內(nèi)容與方法： (1)骨關(guān)節(jié)結(jié)核病灶結(jié)核桿菌培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn)：納入72例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者，通過液體培養(yǎng)基及BACT/ALERT3D系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性者接種L-J培養(yǎng)基，按絕對濃度法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，研究分析重慶地區(qū)骨關(guān)節(jié)結(jié)核耐藥流行情況，以選用耐藥率較低的藥物；(2)骨關(guān)節(jié)結(jié)核病灶利福平、異煙肼濃度檢測：分別建立高效液相法檢測利福平、異煙肼條件，檢測36例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者

4、病灶內(nèi)利福平和異煙肼藥物濃度，以明確局部用藥的必要性；(3)高濃度利福平對耐利福平結(jié)核分枝桿菌殺菌效果測定：復(fù)蘇18株利福平耐藥菌株，采用微陣列基因芯片檢測rpoB基因突變，研究遞增濃度利福平(2，4，8，16，32，64，128，256μg/ml)對耐利福平菌株殺菌效果，并分析rpoB基因突變與利福平耐藥度相關(guān)性。(4)山羊冷凍干燥同種異體骨支架材料的制備：遵守美國組織庫協(xié)會(AATB)標(biāo)準(zhǔn)，制備山羊冷凍干燥同種異體髂骨及松質(zhì)骨，掃描

5、電鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)，測量孔隙率及密度；(5)選用纖維蛋白多聚體固定利福平晶體，優(yōu)化其配方：采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，組成9種纖維蛋白膠組成配方(纖維蛋白原3個(gè)濃度，凝血酶3個(gè)濃度，氯化鈣40mg/ml，氨甲環(huán)酸10mg/ml)，制備纖維蛋白膠圓餅，甲醇作為利福平溶劑，將利福平晶體分布于纖維蛋白多聚體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)內(nèi)，體外緩釋優(yōu)化纖維蛋白膠配方；(6)負(fù)壓灌注法制備植入型利福平緩釋系統(tǒng)：進(jìn)一步研制負(fù)壓灌注系統(tǒng)，依次將配方優(yōu)化后纖維蛋白多聚體和利福平灌入松

6、質(zhì)骨孔隙內(nèi)，制備植入型利福平緩釋系統(tǒng)，掃描電鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)，測定載藥量、載藥率。(7)植入型利福平緩釋系統(tǒng)體外緩釋參數(shù)及抗結(jié)核活性：山羊血清作為體外緩釋分散介質(zhì)，37℃避光，定期換液取樣，高效液相色譜法檢測其緩釋特性；結(jié)核分支桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種液體培養(yǎng)基，體外檢測3種植入型利福平緩釋系統(tǒng)抗結(jié)核能力。(8)利福平對MSCs增殖和成骨分化的影響：分離、培養(yǎng)人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)基內(nèi)加入梯度濃度(4-128ug/ml)利福平，定期(1、

7、3、5、7d)顯微鏡觀察、MTT法檢測不同濃度利福平對MSCs增殖的影響；成骨誘導(dǎo)28天，茜素紅染色、骨鈣素染色、real-time RT-PCR及western blot檢測不同濃度利福平對MSCs成骨指標(biāo)的影響；(9)植入型利福平緩釋系統(tǒng)體內(nèi)緩釋研究：建立山羊體內(nèi)評價(jià)模型，將植入型利福平緩釋系統(tǒng)分別置入椎間、髂骨內(nèi)缺損處，髂骨處定期抽液，高效液相色譜法評價(jià)植入型利福平緩釋系統(tǒng)體內(nèi)緩釋特性，并利用大體觀察、X線片、CT三維重建、組織病

8、理學(xué)評估植入型利福平緩釋系統(tǒng)椎間植骨成骨融合效果。 研究結(jié)果： (1)骨關(guān)節(jié)結(jié)核病灶結(jié)核桿菌培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn)：72例中培養(yǎng)陽性31例(43.1％)，其中人型結(jié)核桿菌28例，牛型結(jié)核桿菌3例。全部敏感16例，耐藥15例，其中耐1種藥物8例，耐2種藥物5例，耐4種藥物l例，耐5種藥物l例。耐藥種類：異煙肼耐藥8例，利福平均耐藥2例，鏈霉素耐藥4例，乙胺丁醇耐藥2例，力克肺疾耐藥2例，左氧氟沙星耐藥9例；(2)骨關(guān)節(jié)結(jié)核病灶利福

9、平、異煙肼濃度檢測：6例能維持利福平有效殺菌濃度4.60±0.76 ug/ml，7例檢測不到，其余23例患者低于有效殺菌濃度，平均0.78±0.45ug/ml:異煙肼濃度：34例患者結(jié)核病灶異煙肼濃度平均0.543±0.132(0.332-0.704)ug/ml，達(dá)到有效殺菌濃度。(3)高濃度利福平對耐利福平結(jié)核分枝桿菌殺菌效果測定：18株利福平耐藥菌株中有17株(94.4％)檢測到rpoB基因突變，1例未檢測到突變。突變位點(diǎn)位于531

10、(55.56％)，526(11.11％)，516(16.67％)and513(11.11％)；與低水平耐藥相比，高水平耐藥(250μg/ml)出現(xiàn)531-Ser突變較高。11例MIC超過256μg/ml(超過設(shè)計(jì)濃度高限，故未檢測)，其余7株結(jié)核桿菌MICs為32-256μg/ml，特別是低水平耐藥者多可被較高濃度利福平殺滅、抑制。(4)山羊冷凍干燥同種異體骨支架材料的制備：冷凍干燥同種異體髂骨支架材料呈乳白色，質(zhì)硬，具有骨組織天然三維

11、網(wǎng)狀孔隙，孔隙內(nèi)潔凈，相互連通。密度為0.39±0.03 g/ml，孔隙率61.23±9.12％?？讖?93±23.2(188～487)um，皮質(zhì)骨厚度1.59±0.16(1.09～2.08)mm。(5)選用纖維蛋白多聚體固定利福平晶體，優(yōu)化其配方：在9組正交實(shí)驗(yàn)中，3、5、8號纖維蛋白膠配方三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與利福平顆粒均勻交替分布，這3組雖有突釋現(xiàn)象，但緩釋曲線較平穩(wěn)，能維持較高的利福平濃度，49天時(shí)其濃度分別為6.22、8.23、7.6

12、3ug/ml。(6)負(fù)壓灌注法制備植入型利福平緩釋系統(tǒng)：采用3、5、8號配方制備3組植入型利福平緩釋系統(tǒng)，外觀呈鮮紅色，藥物分布均勻，纖維蛋白膠將骨塊孔隙封閉。掃描電鏡可見纖維蛋白膠將骨塊孔隙封閉，纖維蛋白膠將利福平晶體固定于孔隙表面和內(nèi)部。(7)植入型利福平緩釋系統(tǒng)體外緩釋參數(shù)及抗結(jié)核活性：8號配方仍有突釋，3、5號配方突釋現(xiàn)象有明顯改善，緩釋曲線平穩(wěn)。3號配方可維持有效殺菌濃度42天，49天時(shí)檢測不到。5號配方至少可維持49天。三組

13、均可有效殺滅結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株。(8)利福平對MSCs增殖和成骨分化的影響：0-16 ug/ml利福平與MSCs具有良好的相容性，對其增殖無明顯影響；利福平濃度>32ug/ml明顯抑制MSCs增殖；0-8 ug/ml利福平對MSCs成骨誘導(dǎo)分化無明顯影響，利福平濃度>16ug/ml明顯抑制MSCs I型膠原、骨橋蛋白、堿性磷酸酶表達(dá)；(9)植入型利福平緩釋系統(tǒng)體內(nèi)緩釋評價(jià)：植入型利福平緩釋系統(tǒng)體內(nèi)緩釋時(shí)，隨時(shí)間延長局部成骨環(huán)境內(nèi)利福平濃度

14、逐漸降低，維持利福平有效殺菌濃度超過42天，濃度為13.55ug/ml，49天時(shí)利福平濃度為2.23 ug/ml。術(shù)后9月實(shí)驗(yàn)組與對照組均達(dá)到骨性融合。 結(jié)論： 1、結(jié)核桿菌快速培養(yǎng)聯(lián)合絕對濃度法藥敏試驗(yàn)準(zhǔn)確度高，費(fèi)用低，可檢測常用一線、二線藥物敏感性，適用于指導(dǎo)骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者個(gè)體化化療方案的制定；骨關(guān)節(jié)結(jié)核利福平耐藥率相對較低； 2、部分患者骨關(guān)節(jié)結(jié)核病灶中利福平難以維持有效殺菌濃度； 3、高濃度利福平