AMPK-Cnrk1在里氏木霉纖維素酶基因表達(dá)調(diào)控中的功能研究.pdf

1、里氏木霉（Trichoderma reesei）是工業(yè)生產(chǎn)纖維素酶的模式菌株，其外切葡聚糖酶CBH1占其分泌總纖維素酶系的60％。cbh1基因的表達(dá)受到碳源的嚴(yán)格調(diào)控:纖維素存在時其表達(dá)量可提高1000倍以上，而葡萄糖條件下其表達(dá)則完全被抑制，即存在葡萄糖阻遏效應(yīng)(又稱碳代謝抑制carbon cataboliterepression，CCR)。
　　AMPK(AMP-activated protein kinase)是一種保守的異

2、源三聚體蛋白質(zhì)激酶，存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中，其酶活力能夠被AMP上調(diào)。在釀酒酵母碳代謝抑制中AMPK通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄抑制因子Mig1的活性起作用。在里氏木霉的CCR過程中與Mig1起相似作用的蛋白為Cre1。但研究表明，在多細(xì)胞的絲狀真菌中AMPK的作用可能與在酵母中的有所不同。里氏木霉的AMPK可以將酵母Mig1的絲氨酸活性位點(diǎn)磷酸化但對自身Cre1無此作用;在Aspergillus nidulans中CreA與AMPK沒有相互作用。另外

3、，該激酶可以通過Snf1和Rgt2/Snf3系統(tǒng)影響葡萄糖信號感應(yīng);在轉(zhuǎn)錄水平影響包括轉(zhuǎn)錄激活因子和轉(zhuǎn)錄抑制因子的磷酸化、核染色質(zhì)的修飾、RNA PolⅡ的活性、細(xì)胞質(zhì)mRNA的穩(wěn)定性、乙酰輔酶A的平衡和組蛋白的乙?；趦?nèi)的多個基因調(diào)控步驟;在轉(zhuǎn)錄后水平通過抑制主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Gcn4的翻譯從而間接在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)編碼氨基酸生物合成酶基因的表達(dá)。
　　綜上所述，由于AMPK在絲狀真菌CCR中的作用有別于酵母并且可以通過多種途徑影響

4、碳源代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，那么在里氏木霉中對纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是否有影響？因此，本論文針對上述問題，對里氏木霉中編碼其同源蛋白的基因cnrk1進(jìn)行了敲除并構(gòu)建了具有不同Cnrk1激酶活性的突變株，以研究該蛋白在維素酶基因誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄中可能的作用和機(jī)制。取得的主要成果如下:
　　一、通過同源性驗證，證明了里氏木霉Cnrk1和釀酒酵母AMPK存在功能差異，并證明蛋白C端的低保守性可能是引起這種差異的主要原因
　　為了驗證二者的同源

5、性，首先構(gòu)建了里氏木霉Cnrk1缺失菌，一方面將酵母AMPK全蛋白基因及其超活性突變體AMPKG53R的基因回補(bǔ)到里氏木霉Cnrk1缺失菌中，在1％ Avicel誘導(dǎo)時纖維素酶的產(chǎn)生并不能恢復(fù)到野生型TU6水平;另一方面將里氏木霉Cnrk1全蛋白及其通過氨基酸突變得到的一系列突變體的系列基因回補(bǔ)到酵母AMPK缺失菌MCY4908中也沒有彌補(bǔ)蔗糖利用缺陷;而將里氏木霉Cnrk1-N端和釀酒酵母AMPK-C端融合回補(bǔ)到MCY4908中則使其

6、恢復(fù)了蔗糖利用能力。因此我們認(rèn)為里氏木霉Cnrk1和釀酒酵母AMPK存在功能上的差異，且這種差異可能是由于蛋白C端保守性較低引起的。
　　二、通過里氏木霉Δcnrk1突變株的表型測定證明了該基因在碳源利用、菌絲體生長、孢子存活率及纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要功能
　　以里氏木霉野生型TU6為出發(fā)菌株構(gòu)建了Δcnrk1突變株，實驗證明該菌株對包括葡萄糖在內(nèi)的各種碳源的利用能力下降;顯微鏡觀察結(jié)果顯示突變株菌絲體比野生型較小;4℃

7、存放條件下孢子的存活率大大降低;與酵母AMPK缺失表型不同的是，里氏木霉細(xì)胞壁的完整性和抗逆性等壓力響應(yīng)過程并沒有受到影響。1％ Avicel誘導(dǎo)條件下突變株主要的纖維素酶CBH1表達(dá)量和pNPC酶活升高，且這種升高是由于cbh1基因在轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)引起的。
　　三、通過Cnrk1不同活性突變體的回補(bǔ)，證明該蛋白在里氏木霉纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄中起負(fù)調(diào)控因子的作用
　　與TU6相比，Cnrk1G18R突變株對各種碳源的利用能力減弱

8、，并且喪失了利用Avice1和Lactose的能力，在0.5％ xylan誘導(dǎo)條件下可以生長但胞外蛋白濃度和木聚糖酶活與TU6相比有減弱。因此我們得出結(jié)論:Cnrk1作為負(fù)調(diào)控因子在Avicel和Lactose誘導(dǎo)途徑中起顯著作用而對Xylan誘導(dǎo)途徑影響較小。
　　四、通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到與里氏木霉Cnrk1相互作用的蛋白
　　通過酵母雙雜交系統(tǒng)我們篩選到13種可能與里氏木霉Cnrk1相互作用的蛋白:AMPKβ亞基，A