實時定量PCR法分析2型糖尿病患者腸道乳酸桿菌菌種數(shù)量的改變.pdf

1、[研究背景]
　　 隨著人們生活水平的提高，2型糖尿病患病率在全球范圍內(nèi)呈逐年升高趨勢，正逐漸成為威脅人類健康的“頭號殺手”之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病的發(fā)生機制除了與基因及飲食結(jié)構(gòu)、體力活動等環(huán)境因素有關(guān)之外，還與腸道菌群關(guān)系密切。研究表明，2型糖尿病患者或動物模型與正常對照者相比腸道菌群構(gòu)成發(fā)生了改變，這可能是引起胰島素抵抗及糖尿病的因素。還有動物實驗發(fā)現(xiàn)，通過改變飲食因素使腸道菌群構(gòu)成發(fā)生變化能引起肥胖，進而增加糖尿病

2、的風險。因此腸道菌群與代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，已成為國內(nèi)外研究的新熱點。人體消化道定植著相當復雜又相對穩(wěn)定的腸道菌群，在能量代謝、免疫防御、合成人體必需的微量元素及礦物質(zhì)等方面發(fā)揮著不可替代的作用。其中，乳酸桿菌普遍存在于人類消化道中，并且經(jīng)常作為益生菌加入食品中。目前，腸道微生物與人類健康的相互作用仍存在分歧，它們影響人體代謝的機制仍不十分清楚。有實驗發(fā)現(xiàn)，服用干酪乳酸桿菌能減輕大鼠的肥胖及胰島素抵抗。然而也有實驗表明，乳酸桿菌

3、能引起炎癥反應，而炎癥反應又與肥胖及2型糖尿病有關(guān)。
　　 [目的]
　　 本研究擬從腸道菌群角度，應用實時熒光定量PCR技術(shù)，比較我國2型糖尿病人群與血糖正常人群腸道總?cè)樗釛U菌及其具體菌種（嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌）數(shù)量的差異，并且分析乳酸桿菌數(shù)量與血糖、血脂等代謝性指標的相關(guān)性，從而為2型糖尿病的發(fā)病機制提供新線索，為2型糖尿病的防治尋求新靶點。
　　 [方法]

4、　　 選取2010年8月——2010年10月在廣東某社區(qū)醫(yī)院病房住院及門診隨診的2型糖尿病病人50人，同時選取30名健康對照者，性別、年齡、BMI相匹配，并排除腫瘤、肝腎等臟器嚴重損害、患有甲狀腺等其它內(nèi)分泌疾病、1月內(nèi)服用抗生素及微生態(tài)制劑、近4周內(nèi)患腹瀉病或其它胃腸道疾病者。收集每個2型糖尿病患者空腹血樣品，進行空腹血糖(FBG)、胰島素、C肽、糖化血紅蛋白(HbA1C)、血脂（包括TC、LDL-C、HDL-C、TG）、C反應蛋白

5、(CRP)濃度測定，進行OGTT試驗，收集2h后血樣品進行餐后2h血糖(PBG)、胰島素、C肽濃度測定。收集每個研究對象當日糞便樣品，稱取濕重糞便樣品每份2g，經(jīng)反復離心、去除雜質(zhì)、洗滌，得到菌體沉淀，用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌總DNA。根據(jù)待測目標細菌16SrRNA基因序列設(shè)計特異性引物，將10倍系列稀釋的標準品與糞便細菌DNA樣品同時進行實時熒光定量PCR反應，每次反應體系和反應條件均相同，每次實驗同時設(shè)標準品及空白對照，

6、每個樣品均同時做2個平行復孔。反應完畢后根據(jù)熔解曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性，根據(jù)Ct值及標準曲線計算每克糞便樣品中待測細菌基因的拷貝數(shù)，作為定量結(jié)果。將此定量結(jié)果經(jīng)log10轉(zhuǎn)換后錄入SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。應用兩獨立樣本t檢驗比較組間差異。用K類中心聚類法根據(jù)所含細菌數(shù)目的差異將所有研究對象分成相互獨立的兩類，用兩獨立樣本t檢驗比較兩類間目標細菌的差異，用兩獨立樣本率比較的x2檢驗比較兩類中糖尿病患者的百分比來判斷該分類方法

7、與糖尿病之間是否存在關(guān)聯(lián)，并計算敏感性、特異性。用Pearson相關(guān)分析總?cè)樗釛U菌拷貝數(shù)與糖尿病患者脂代謝指標、糖代謝指標、炎癥指標的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 [結(jié)果]
　　 用兩獨立樣本t檢驗對乳酸桿菌屬及其具體菌種實時定量PCR結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，糖尿病組(7.771±0.874)乳酸桿菌含量顯著高于對照組(6.606±0.586)（P＜0.001）;糖尿病組(4.550±0.674)嗜酸乳桿

8、菌含量顯著高于對照組(2.904±0.614)（P＜0.001）;糖尿病組(5.016±1.047)干酪乳桿菌含量顯著高于對照組(4.504±0.938)（P=0.031）;糖尿病組(5.188±0.681)保加利亞乳桿菌含量顯著高于對照組(4.550±0.674)（P＜0.001);糖尿病組(3.744±0.995）鼠李糖乳桿菌含量顯著高于對照組(2.730±0.459)（P＜0.001);糖尿病組(4.698±0.938)植物乳桿菌

9、含量低于對照組(4.619±0.657)，但差異不具有顯著性（P=0.685）。通過聚類分析得到相互獨立、菌群構(gòu)成特征不同的兩類，其中第一類含有顯著增多的總?cè)樗釛U菌（7.8±0.9P＜0.001）、嗜酸乳桿菌（5.2±1.0 P＜0.001）、保加利亞乳桿菌（5.2±0.6P=0.038）、干酪乳桿菌（5.2±1.2 P=0.007）及鼠李糖乳桿菌（4.0±1.1 P＜0.001)，第二類含有顯著減少的總?cè)樗釛U菌（7.0±0.9 P＜0

10、.001)、嗜酸乳桿菌（2.9±0.6 P＜0.001）、保加利亞乳桿菌（4.8±0.8 P=0.038）、干酪乳桿菌（4.6±0.8 P=0.007）及鼠李糖乳桿菌（2.9±0.6 P＜0.001)。且該分類與糖尿病之間存在聯(lián)系，第一類中糖尿病患者所占百分比顯著高于第二類（x2=25.368 P＜0.001)。本實驗通過腸道菌群分析預測糖尿病的敏感性為0.600，特異性為0.967。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示乳酸桿菌與脂代謝指標顯

11、著相關(guān)，與糖代謝指標、炎癥指標之間未發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)性?？?cè)樗釛U菌與低密度脂蛋白膽固醇顯著負相關(guān)（Rp=-0.252P=0.039），與總膽固醇（Rp=-0.215 P=0.067）、甘油三酯（Rp=-0.161 P=0.132）、高密度脂蛋白膽固醇（Rp=-0.157 P=0.138）呈負相關(guān)，但相關(guān)性不具有統(tǒng)計學意義。
　　 [結(jié)論]
　　 本研究通過對乳酸桿菌屬及具體菌種的定量分析比較，可以初步認為:乳酸桿菌及其具體菌

12、種嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌在2型糖尿病人群和血糖正常人群中存在差異，2型糖尿病人群中上述菌屬及菌種增多。且研究結(jié)果顯示通過分析腸道菌群構(gòu)成的方法來判斷糖尿病的風險具有較高的特異性，為2型糖尿病高危人群的判斷及2型糖尿病早期防治提供了新的線索。在所有代謝指標中，發(fā)現(xiàn)低密度脂蛋白膽固醇與乳酸桿菌顯著負相關(guān)?？梢酝茰y，腸道菌群對血脂代謝具有一定的調(diào)節(jié)作用。通過飲食調(diào)節(jié)腸道乳酸桿菌含量可能有助于改善糖尿病、高脂血癥等