門靜脈血氨對(duì)仔豬肝臟氨基酸代謝的影響.pdf

1、肝臟是氨氮代謝的主要器官，來自腸道的血氨經(jīng)門靜脈進(jìn)入肝臟主要通過尿素循環(huán)代謝。豬門靜脈血氨濃度是循環(huán)系統(tǒng)其他部位的10倍，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)隨著日糧蛋白水平的升高，豬門靜脈血氨濃度達(dá)到250μmol/L-350μmol/L。本課題旨在研究門靜脈血氨對(duì)仔豬肝臟氨基酸代謝的影響。首先通過安裝門靜脈-肝靜脈插管建立仔豬門靜脈灌注技術(shù);通過門靜脈灌注高濃度（75mmol/L）和低濃度(25 mmol/L)的氯化銨（NH4Cl）溶液，采集肝靜脈血

2、液以及肝臟組織樣品，基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)的代謝組學(xué)分析了血液中的代謝產(chǎn)物變化;數(shù)字基因表達(dá)譜分析了肝臟組織基因表達(dá)，并檢測(cè)了相關(guān)代謝酶活性;最后利用15N同位素研究NH4Cl對(duì)肝細(xì)胞氨基酸代謝影響的機(jī)制。主要的研究結(jié)果如下:
　　(1)仔豬肝臟門靜脈灌注技術(shù)的建立:通過門靜脈血流速率以及攝食前后門靜脈血氨的濃度，計(jì)算出門靜脈血氨流量（μmol/min）;設(shè)定體外灌注泵的速率(mL/min)，計(jì)算出體外灌注氨的濃度;

3、仔豬安裝門靜脈-肝靜脈插管，待恢復(fù)健康后利用灌注泵通過門靜脈插管進(jìn)行體外灌注NH4Cl溶液。通過檢測(cè)肝靜脈血液尿素含量發(fā)現(xiàn)，隨著門靜脈灌注NH4Cl的濃度增加，血液中尿素濃度也增加。這些結(jié)果證實(shí)了仔豬肝臟門靜脈灌注技術(shù)的可靠性。
　　(2) GC-MS分析結(jié)果顯示:灌注不同濃度的NH4Cl引起12種血清差異代謝產(chǎn)物;與低濃度NH4Cl相比，門靜脈灌注高濃度NH4Cl導(dǎo)致尿素和谷氨酰胺合成明顯增加，同時(shí)葡萄糖和葡萄糖-6磷酸也顯著增

4、加;相反地，在高濃度組中丙氨酸(Ala)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸、鳥氨酸、精氨酸等氨基酸含量大量降低，其中Ala差異變化最大。
　　(3)數(shù)字基因表達(dá)譜分析結(jié)果顯示:與低濃度組相比，高濃度組中共有1164個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)，其中有901個(gè)DEGs上調(diào)，263個(gè)DEGs下調(diào)。在這些DEGs中，尿素循環(huán)相關(guān)基因如N-乙酰谷氨酸合成酶、氨甲酰磷酸合成酶1、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶、及精氨酸酶1基因表達(dá)大量上調(diào);氨基酸相關(guān)代謝酶基因

5、也發(fā)生明顯的變化，如谷氨酰胺合成酶、鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶等;通過定量PCR驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)一致性較高，說明測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
　　(4)肝臟代謝酶活性分析結(jié)果顯示:高濃度組中氨甲酰磷酸合成酶1、精氨酸1、谷氨酰胺合成酶活性顯著高于低濃度組;而高濃度組中鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶和谷氨酰胺酶活性較低濃度組有增加的趨勢(shì);并且隨著NH4Cl灌注濃度的增加，肝臟中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活性分別提高了45.89％和41

6、.08％。這些結(jié)果說明門靜脈灌注氨導(dǎo)致ALT和AST酶活性增加。
　　(5)通過GC-MS分析不同15N底物條件下尿素和Asp中15N豐度，結(jié)果顯示:當(dāng)肝細(xì)胞培養(yǎng)在15NH4Cl中，尿素中兩個(gè)氮原子只有一個(gè)氮被大量標(biāo)記（Urea(m+1)），Asp中15N標(biāo)記量很少;當(dāng)在肝細(xì)胞中添加NH4Cl和15N-Ala時(shí)，尿素只有一個(gè)氮原子被大量標(biāo)記，且Asp也被大量標(biāo)記，其15N豐度是15NH4Cl組的4倍;當(dāng)同時(shí)添加15NH4Cl和15

7、N-Ala時(shí)，尿素中兩個(gè)氮原子均被大量標(biāo)記，Asp中15N豐度與15N-Ala+NH4Cl組沒有明顯差異，然而Urea(m+1)中15N豐度明顯減少。這些結(jié)果表明氨不能為尿素循環(huán)提供兩個(gè)氮原子，Ala通過轉(zhuǎn)化成Asp為尿素合成提供前體物質(zhì)。
　　綜上所述:門靜脈血氨進(jìn)入肝臟尿素循環(huán)后，氨只能為尿素提供一個(gè)氮源，另外一個(gè)氮源主要是通過氨基酸代謝供給;因此，氨進(jìn)入肝臟尿素循環(huán)后會(huì)誘導(dǎo)Ala代謝，在ALT和AST的作用下合成Asp，為尿