前扣帶皮層吻側(cè)神經(jīng)元NR2B受體介導(dǎo)骨癌痛大鼠痛敏及痛厭惡情緒體驗的研究.pdf

1、研究背景：
　　隨著人們對NR2B研究的深入，由于NR2B局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分布，使得研究者更期待能夠研制出作用于NR2B的藥物，從而更精細(xì)，更準(zhǔn)確的作用調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，參痛厭惡情緒的調(diào)節(jié)與處理，并能減少使用非選擇性NMDA受體拮抗劑帶來如幻覺、煩躁不安等副作用。近年來大量的研究轉(zhuǎn)向這一方向:龍膽苦苷不僅能有效的抑制炎癥相關(guān)的異常性疼痛，而且減少了ACC的NR2B的表達(dá)，說明龍膽苦苷的鎮(zhèn)痛作用與ACC應(yīng)對周圍傷害性刺激引起的谷氨酸能的

2、突觸傳遞密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，選擇性的NR2B受體拮抗劑ifenprodil可以高效選擇性作用于NR2B受體，抑制NR2B亞基的表達(dá)，減輕背根神經(jīng)節(jié)壓縮性損傷引起的傷害性疼痛。Ifenprodil結(jié)合于NR2B亞基N末端發(fā)揮作用，已經(jīng)被用于評估NR2B受體在大腦功能和疾病方面的作用，可望用于治療疼痛、心境障礙和神經(jīng)變性等疾病。
　　小干擾RNA技術(shù)是采用從基因遺傳學(xué)研究的角度出發(fā)，運(yùn)用重組慢病毒載體干擾，下調(diào)或沉默靶基因的技術(shù)，具有

3、高效、特異、穩(wěn)定、周期短及操作簡單等優(yōu)勢。Tan等利用鞘內(nèi)注射siRNA技術(shù)，下調(diào)NR2B基因的表達(dá)，從而有效抑制福爾馬林刺激引起的傷害性痛厭惡情緒體驗。
　　本研究擬首先構(gòu)建NR2B/RNAi重組慢病毒表達(dá)載體，然后在大鼠腦立體定位儀的引導(dǎo)下將該重組慢病毒載體注入脛骨骨癌痛大鼠的rACC腦區(qū)，通過沉默骨癌痛大鼠rACC腦區(qū)神經(jīng)元NMDA受體2B亞基的表達(dá)，觀察NR2B/RNAi對癌痛慢性痛伴隨的痛不良情緒體驗的影響，期望為臨床癌

4、痛等慢性痛患者的不良情緒的治療提供動物學(xué)基礎(chǔ)研究的支持。
　　研究方法與結(jié)果：
　　1、rACC腦區(qū)注射選擇性的NR2B受體阻斷劑Ifenprodil對骨癌痛大鼠伴隨痛厭惡情緒體驗的影響
　　方法：按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取無位置偏愛的雄性Wistar大鼠30只隨機(jī)分為空白對照組(n=10)和骨癌痛組(n=20)，骨癌痛組大鼠右脛骨骨髓腔接種MADB-106細(xì)胞3μl（4.8×109個/ml），而空白對照組給予同等劑量的

5、生理鹽水作對照。骨癌痛組大鼠根據(jù)是否給予NR2B受體拮抗劑Ifenprodil治療進(jìn)一步分為治療組(n=10)及非治療組(n=10)，術(shù)后第14天即條件性位置回避訓(xùn)練前10min，治療組大鼠rACC內(nèi)注射NR2B受體阻斷劑Ifenprodill.2μl(0.2g/L)，而非治療組大鼠給予同等劑量的生理鹽水作為對照。采用VonFrey機(jī)械刺激法測量大鼠右后爪機(jī)械刺激痛閾的變化。采用機(jī)械刺激誘導(dǎo)觸誘發(fā)痛和條件性位置回避實驗測定骨癌痛大鼠伴隨

6、的痛厭惡情緒體驗（實驗裝置由A和B兩室組成，大鼠處于A室時機(jī)械刺激術(shù)側(cè)后爪誘發(fā)觸痛，而處于B室刺激對側(cè)作為對照。計算30min內(nèi)大鼠在A室所占時間的百分比以反映痛厭惡情緒）。
　　結(jié)果：接種MADB-106細(xì)胞第10天骨癌痛組大鼠術(shù)側(cè)后爪痛閾值明顯降低(P＜0.05)，術(shù)后第12天和第14天一直處于較低水平，而空白對照組術(shù)側(cè)后爪機(jī)械痛閾無顯著改變。組間比較術(shù)后第10、12和14天骨癌痛組明顯低于空白對照組(P＜0.05)。條件性位

7、置回避訓(xùn)練實驗中，非治療組大鼠在A室滯留時間的百分比為(30±4)％，低于C組(52±5)％(P＜0.05);治療組大鼠在A室滯留時間的百分比為(42±5)％，較非治療組升高，但仍低于空白對照組(P＜0.05)。
　　2、rACC腦區(qū)注射NR2B/shRNA重組慢病毒對骨癌痛誘導(dǎo)的痛厭惡情緒體驗的沉默效應(yīng)
　　方法：按照隨機(jī)數(shù)字表法選取正常雄性Wistar大鼠45只，隨機(jī)分為生理鹽水空白對照組（NS組）、NR2B/RNAi干

8、擾慢病毒組（LV-NR2B組）和pGC-FU/RNAi組(LV-NC組)。首先向各組大鼠右脛骨骨髓腔接種MADB-106細(xì)胞3μl(4.8×109個/ml)制備骨癌痛模型，然后在大鼠腦立體定位儀引導(dǎo)下向LV-NR2B組大鼠rACC注射NR2B/siRNA重組慢病毒(0.2μl，109TU/ml)，注藥后再注入2μl的生理鹽水，以保證藥物在rACC腦區(qū)內(nèi)。而LV-NC組和NS組大鼠分別注入相同容量的pGC-FU/RNAi陰性重組慢病毒和生

9、理鹽水，其余操作同LV-NR2B組。不同時間點(diǎn)采用Von Frey機(jī)械刺激法測量大鼠右后爪機(jī)械刺激痛閾的變化。采用機(jī)械刺激誘導(dǎo)觸誘發(fā)痛和條件性位置回避實驗測定骨癌痛大鼠伴隨的痛厭惡情緒體驗（實驗裝置由A和B兩室組成，大鼠處于A室時機(jī)械刺激術(shù)側(cè)后爪誘發(fā)觸痛，而處于B室刺激對側(cè)作為對照。計算30min內(nèi)大鼠在A室所占時間的百分比以反映痛厭惡情緒體驗）。行為學(xué)實驗結(jié)束后，處死各組大鼠，取ACC組織分別用RT-PCR、Western Blott

10、ing法和免疫熒光技術(shù)檢測NR2BmRNA和NR2B蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：接種MADB-106細(xì)胞第7天LV-NC組和NS組大鼠術(shù)側(cè)后爪痛閾值開始降低，術(shù)后第14天和第21天一直處于較低水平(P＜0.05);組間比較術(shù)后第14和21天LV-NC組和NS組大鼠機(jī)械刺激痛閾值明顯低于LV-NR2B組(P＜0.05)。條件性位置回避訓(xùn)練實驗中，LV-NR2B組大鼠在A室滯留時間的百分比為(46.46±1.31)％，較LV-NC組大

11、鼠(32.11±2.23)％和NS組大鼠(31.89±1.43)％升高(P＜0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示，LV-NC組NR2B基因mRNA表達(dá)與NS組比較無顯著差異，LV-NR2B組大鼠NR2B基因mRNA表達(dá)較LV-NC組和NS組均明顯下降(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Western blot結(jié)果顯示，LV-NR2B組NR2B蛋白的表達(dá)明顯低于LV-NC組和NS組(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而LV-NC組和NS組大鼠

12、NR2B蛋白的表達(dá)無明顯差異。隨機(jī)拍取的免疫熒光圖片顯示，LV-NR2B組熒光表達(dá)較LV-NC組和NS組明顯減少(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　研究總結(jié)：
　　前扣帶回皮層吻側(cè)部注射高選擇性的NR2B受體阻斷劑ifenprodil能夠減輕骨癌痛大鼠伴隨的痛厭惡情緒體驗。同時，采用NR2BsiRNA技術(shù)沉默rACC區(qū)NR2B亞基的表達(dá)有效地減弱了骨癌痛伴隨的痛厭惡情緒。本研究可為骨癌痛伴隨痛厭惡情緒的臨床治療和相關(guān)研