溫熱對尖銳濕疣組織中HPV早期基因、干擾素及其相關信號途徑的影響.pdf

1、人類乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是乳多空病毒科多瘤病毒亞科的一組嗜黏膜和皮膚上皮的雙鏈環(huán)狀DNA病毒,其感染靶器官主要為上皮組織,顯示高度的宿主特異性,對人體特異部位的上皮細胞具親和力。HPV感染可以引起皮膚粘膜的良性增生性病變?nèi)琊?甚至引起惡性腫瘤的發(fā)生?，F(xiàn)已鑒定出120余種HPV基因型。現(xiàn)階段臨床治療上主要采用理化(如冷凍、電灼術、高熱激光、化學腐蝕)、細胞毒類藥物等創(chuàng)傷性方法治療疣。由于感染局部

2、免疫缺陷以及缺乏有效的特異性抗病毒制劑和徹底根治的物理方法,導致感染遷延不愈。隨著熱療的生理和病理生理學研究逐步深入,以及測溫、控溫和加溫技術的不斷進步,熱療得到了迅速的發(fā)展。在過去的幾十年內(nèi),溫熱曾用于治療動物和人類多種表淺和深層的良惡性腫瘤。我國傳統(tǒng)醫(yī)學有成功利用灸烤療法治療疣的經(jīng)驗。國外有一些臨床報告,初步觀察到溫熱對尋常疣、跖疣有較好的治療效果。我們采用自行研究的遠紅外加熱儀在42-45℃溫熱條件下照射20-30分鐘治療疣,取得

3、滿意的療效。
　　 有研究認為溫熱引起病變組織壞死,物理性地去除了HPV病毒,如同其它破壞性物理治療手段一樣,也可能是由于溫熱直接引起病毒破壞或者是由于炎癥反應導致病毒的去除。王曉琴等研究表明溫熱可促進尖銳濕疣及正常皮膚角質形成細胞的凋亡,并呈溫度依賴性,尖銳濕疣角質形成細胞與正常角質形成細胞相比對溫熱更敏感。細胞介導的免疫應答是HPV感染角質形成細胞清除及疣體消退的主要因素,李曉東等研究表明溫熱能夠促進朗格漢斯細胞(Lange

4、rhans cell,LC)成熟,促進LC的遷移和增強抗原提呈能力,LC通過真皮向局部淋巴結遷移,在局部細胞免疫應答中發(fā)揮作用。
　　 HPV在56℃30分鐘的條件下才能滅活,所以溫熱的作用(39-45℃)并不是對病毒的直接殺滅,但溫熱是否能抑制HPV的某些活性成分(如E6、E7基因表達)并作為局部溫熱治療疣的機制之一,目前尚不清楚。干擾素(Interferon,IFN)家族是在抗病毒過程中誘導的分泌型蛋白,主要分為Ⅰ型IFN(

5、包括IFN-α、-β)與Ⅱ型IFN(IFN-γ),IFN通過與細胞表面的受體結合從而觸發(fā)JAK-STAT信號途徑活化進而誘導下游蛋白酶轉錄表達,從而發(fā)揮抗病毒生物學活性。有研究表明溫熱能誘導IFN表達增加,Taylor等報道將EB病毒轉染的B細胞系置于42℃培養(yǎng)條件下,取上清液進行抗病毒活性檢測,發(fā)現(xiàn)該上清液極大的提升了Hep-2細胞對抗水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,vsv)感染的能力,經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)

6、,上清液中發(fā)揮抗病毒作用的是IFN-γ。Taylor發(fā)現(xiàn)溫熱誘導IFN表達的現(xiàn)象只存在于轉染病毒的細胞系中,而未轉染的細胞系經(jīng)溫熱處理后未觀察到相似現(xiàn)象。溫熱影響IFN表達和釋放的同時,對其生物學活性也產(chǎn)生一定的影響。Payne等報道溫熱極大地提高了人IFN-α,-β,-γ,及鼠IFN-γ的抗病毒活性。
　　 我們通過檢測:1、溫熱對HPV基因產(chǎn)物表達(E6/E7)的影響;2、溫熱處理后干擾素及其誘導的下游蛋白酶表達變化;3、溫

7、熱處理后IFN-α/β受體及其相關JAK-STAT信號途徑中信號分子表達變化,探討溫熱對HPV感染的抑制及抗病毒免疫活性研究,為臨床治療疣提供穩(wěn)定、可靠的理論依據(jù)。本研究中,我們采用尖銳濕疣組織標本作為病毒載體,利用溫熱治療儀進行不同溫度照射,采用器官培養(yǎng)的模式,模擬體內(nèi)環(huán)境,開展相關實驗,報道如下:
　　 材料與方法
　　 一、材料
　　 臨床資料:女性尖銳濕疣(Condyloma acuminatum,CA)

8、患者均為我院皮膚科、婦科門診患者,符合2000年衛(wèi)生部防疫司制訂的CA診斷標準。
　　 對照組:正常皮膚取自整形術后。
　　 二、標本處理：征得患者知情同意后,局部消毒麻醉,分別切取疣體/正常皮膚組織,每例組織等分為4份。其中一份OTC包埋劑包埋后直接冷凍保存,另3份真皮側向下,放入少量RPMI-1640培養(yǎng)液,只將疣體底部浸于培養(yǎng)液中分別以37℃、42℃和45℃三種溫度照射30分鐘后,將疣體全部浸于RPMI-1640培

9、養(yǎng)液,37℃培養(yǎng)箱孵育12小時后將組織取出,OCT包埋劑包埋后冷凍保存。
　　 三、HPV型別鑒定檢測：采用TaKaRa公司的Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 DNA純化試劑盒提取DNA,采用HPV6/11型特異性引物進行PCR擴增,采用1.5％瓊脂糖凝膠電泳,紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結果。
　　 四、HPV E6/E7 mRNA的檢測：采用熒光實時定量PCR方法檢

10、測HPV-6 E6/E7,HPV-11 E6/E7 mRNA的表達。按Trnzol試劑說明書提取總RNA;用TIANScript M-MLV試劑盒反轉錄合成cDNA;SYBR-Green法進行熒光實時定量PCR擴增,采用雙標準曲線法進行相對定量分析。
　　 五、干擾素、下游蛋白酶及JAK-STAT途徑相關信號分子mRNA的表達：IFN-α、-β、-γ,PKR,OAS1,IFNAR1,IFNAR2,Jak1,Tyk2,Stat1,

11、Stat2mRNA在不同溫熱條件處理后表達水平變化。方法同三。
　　 六、Western blot檢測蛋白表達水平：組織提取總蛋白,BCA法檢測蛋白質含量。進行SDS-PAGE電泳,轉印至PVDF膜、封閉,PKR,OAS1,p-Stat1,Stat1,p-Stat2,Stat2、β-actin一抗孵育過夜,相應的二抗孵育,增強型化學發(fā)光(enhance chemiluminescence,ECL),拍照,以β-actin為內(nèi)參照

12、,條帶進行灰度值分析。
　　 七、統(tǒng)計學分析：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)結果以x±SE表示,以P＜0.05為判斷差異顯著性標準。組間比較采用方差分析。P＜0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果
　　 一、HPV E6/E7 mRNA在溫熱處理后表達變化E6、E7 mRNA表達均隨局部溫度升高而逐漸減少。HPV-6 E6 mRNA的相對表達量分別為:37℃(1.00±0.00),42

13、℃(0.61±0.17),45℃(0.27±0.15);HPV-6E7 mRNA的相對表達量分別為:37℃(1.00±0.00),42℃(0.56±0.21),45℃(0.16±0.11);HPV-11 E6 mRNA的相對表達量分別為:37℃(1.00±0.00),42℃(0.60±0.22),45℃(0.16±0.08);HPV-11 E7 mRNA相對表達量分別為:37℃(1.00±0.00),42℃(0.55±0.15),45℃

14、(0.24±0.06)。組間比較有顯著性統(tǒng)計學差異(P＜0.001)。
　　 二、溫熱處理后干擾素及其誘導的下游蛋白酶表達變化溫熱處理后,CA組織IFN-α、IFN-β、IFN-γ轉錄水平隨溫度升高表達明顯升高。IFN-α在42℃和45℃溫熱作用下表達水平與對照組相比分別增加了2-5倍和3-6倍,IFN-β表達水平分別增加了2-4倍和3-4倍,IFN-γ表達水平增加了2-5倍4-14倍。CA組織中感染HPV型別與干擾素誘導水平之

15、間無顯著相關性。
　　 OAS1轉錄水平在42℃和45℃溫熱作用下表達水平與對照組相比分別增加5倍和11倍左右;其蛋白表達水平在42℃和45℃溫熱作用下均增加了1-2倍。PKR轉錄水平在42℃溫熱作用下表達水平與對照組相比增加3倍,但在45℃條件時表達水平降低了1/3;其蛋白表達水平在42℃和45℃溫熱作用下均增加了1-2倍。上述指標在正常皮膚組織中未見顯著性改變。
　　 三、溫熱處理后IFN-α/β受體及其相關JAK-

16、STAT信號途徑中分子表達變化CA組織中IFNAR1在42℃和45℃溫熱作用下表達水平與對照組相比分別增加了2-3倍和3-5倍,IFNAR2表達水平則分別增加了2-3倍和2-4倍。Jak1,Tvk2,Stat1和Stat2轉錄水平在42℃和45℃溫熱作用下沒有發(fā)生顯著性改變。P-Stat1蛋白表達水平在42℃和45℃溫熱作用下表達水平與對照組相比均增加了1-2倍(P＜0.001);p-Stat2在42℃和45℃溫熱作用下表達水平分別增加

17、了1.5倍(P＜0.001)和1.8倍(P＜0.001)。正常皮膚組織在溫熱作用前后上述指標均未見顯著性差異。
　　 結論
　　 1、溫熱對HPV-6E6、HPV-6E7、HPV-11E6及HPV-11E7 mRNA表達存在抑制作用,表現(xiàn)為這四種基因mRNA表達隨著溫度的升高而降低。
　　 2、溫熱能誘導HPV感染組織中三種干擾素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)表達增加,這種誘導作用是呈正相關的,即溫度越高

18、,干擾素表達水平越高。CA組織中感染HPV型別與干擾素誘導水平之間無顯著相關性。干擾素相關蛋白酶OAS1轉錄水平及蛋白水平均隨著溫度的升高而升高,PKR轉錄水平在45℃時表達有所下降,但蛋白表達水平仍明顯升高。干擾素、OAS1及PKR表達上調有利于抑制HPV的復制及播散。溫熱作用后正常皮膚組織中上述指標未見顯著性改變,因此推測溫熱對干擾素及其相關蛋白酶表達的調節(jié)作用可能僅限于病毒感染組織。
　　 3、溫熱作用后干擾素受體表達上調