嚴重燒傷大鼠早期腸道營養(yǎng)降低高代謝與CRF受體調(diào)控作用.pdf

1、燒傷高代謝反應(yīng)是嚴重燒傷應(yīng)激、炎癥反應(yīng)的重要組成部分。適當?shù)母叽x反應(yīng)對機體有利，過度高代謝反應(yīng)對機體有害。眾所周知，中樞神經(jīng)系統(tǒng)在燒傷高代謝反應(yīng)中起重要作用，近年來越來越多的資料闡述神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌系統(tǒng)存在相互影響，相互調(diào)節(jié)，這為探討燒傷高代謝發(fā)生機制及其調(diào)理提供了新思路。 機體能量平衡的調(diào)節(jié)機制十分復雜，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，燒傷高代謝反應(yīng)受下丘腦調(diào)控，下丘腦在能量平衡調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。二十多年來神經(jīng)生物學的不斷進展，大量與能

2、量平衡有關(guān)的下丘腦神經(jīng)肽及神經(jīng)遞質(zhì)網(wǎng)絡(luò)相繼被發(fā)現(xiàn)，為探索燒傷高代謝反應(yīng)機制提供了重要的理論基礎(chǔ)。合成代謝作用神經(jīng)肽刺激攝食，降低能量消耗，分解代謝作用神經(jīng)肽抑制攝食，增加能量消耗。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)系統(tǒng)屬分解代謝神經(jīng)肽，CRF相關(guān)肽及其受體在創(chuàng)傷應(yīng)激及能量代謝中的作用已有一些證據(jù)。而且許多其他中樞神經(jīng)肽均通過CRF系統(tǒng)起作用。因此，我們推測下丘腦CRF相關(guān)肽及其受體在燒傷應(yīng)激及燒傷高代謝反應(yīng)中可能起著十分重要作用。CRF

3、相關(guān)肽包括CRF、UCN(Urocortin)1、UCN2、UCN3等。1981年Vale等首先從羊下丘腦分離出CRF，CRF是41個氨基酸的神經(jīng)肽，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)CRF通過與CRFR1、CRFR2兩種高親和力受體亞型結(jié)合，在應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮多種多樣的病理生理作用。研究表明CRFR1受體主要介導HPA軸ACTH、糖皮質(zhì)激素的分泌，CRFR2受體主要介導能量平衡。UCN1是1995年由vaughan等首先報道，是在大鼠腦中發(fā)現(xiàn)的一種普遍存在

4、于哺乳動物中的CRF家族的新成員，與CRF有45％的同源性，UCNs是CRFR2受體的主要配體，研究表明，UCNs可能在燒傷后高代謝反應(yīng)中起重要作用。近年來，CRFR1、CRFR2受體拮抗劑相繼被發(fā)現(xiàn)，Astressin2-B是CRFR2受體特異拮抗劑，Antalarmin是CRFR1受體特異拮抗劑，同時，反義核酸技術(shù)是目前比較成熟的下調(diào)基因表達的方法。CRF受體拮抗劑的應(yīng)用及反義核酸技術(shù)為特異受體作用機制研究提供了重要手段。

5、燒傷高代謝主要來自創(chuàng)面，腸道是燒傷高代謝的另一重要來源。腸道作為外科應(yīng)激的中心器官，腸道在燒傷高代謝反應(yīng)中的作用已有一些證據(jù)。我所通過大量的動物實驗及臨床研究證實早期腸道營養(yǎng)可降低燒傷高代謝反應(yīng)，并由此提出“腸源性高代謝”理論。嚴重燒傷后早期腸道營養(yǎng)通過食物對胃腸道刺激，促進腸道復蘇，改善腸道血循，維護腸道結(jié)構(gòu)功能，調(diào)節(jié)腸道運動、分泌、代謝功能，降低腸道細菌/內(nèi)毒素移位，從而降低燒傷高代謝反應(yīng)。但已有的研究局限在早期腸道營養(yǎng)對靜息能量消

6、耗及腸道結(jié)構(gòu)功能影響的研究，未涉及中樞代謝相關(guān)神經(jīng)肽的變化情況。因此，我們推測，既然“腸源性高代謝”理論認為腸道參與燒傷高代謝的形成，早期腸道營養(yǎng)可降低燒傷高代謝反應(yīng)，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)在燒傷高代謝反應(yīng)中起重要作用，因而可以設(shè)想早期腸道營養(yǎng)在降低燒傷高代謝時，也可能存在由體液和神經(jīng)機制通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)及其代謝相關(guān)肽的調(diào)節(jié)。目前國內(nèi)外尚未見這方面的資料報道。 CRF相關(guān)肽及其受體在胃腸道也有相應(yīng)表達。功能研究顯示大鼠外周靜脈注射CRF

7、、UCN可促進結(jié)腸的推進運動，抑制胃排空，而CRF、UCN不能通過血腦屏障，提示胃腸道局部可能也有CRF相關(guān)肽的合成與分泌，胃腸道內(nèi)存在相應(yīng)CRF受體。近年來，腸道粘膜、粘膜下層CRF相關(guān)肽及受體在腸道應(yīng)激、腸道炎癥反應(yīng)及腸道粘膜屏障功能中作用研究越來越受重視。但嚴重燒傷應(yīng)激后腸道CRF相關(guān)肽及其受體的動態(tài)變化及早期腸道營養(yǎng)對腸道CRF相關(guān)肽及其受體有何調(diào)節(jié)作用?國內(nèi)外未見文獻報道。 本實驗應(yīng)用CRFR1、CRFR2受體的特異性

8、拮抗劑及反義核酸技術(shù)，通過阻斷CRFR1、CRFR2受體作用及下調(diào)下丘腦相應(yīng)受體的表達，試圖探索CRF受體與燒傷高代謝反應(yīng)的關(guān)系；建立燒傷后早期腸道營養(yǎng)與靜脈營養(yǎng)模型，觀察兩種不同的營養(yǎng)支持途徑對燒傷大鼠代謝指標及下丘腦CRF相關(guān)肽及其受體的影響，為腸源性高代謝理論進一步提供依據(jù)；同時，本實驗還對燒傷后早期腸道營養(yǎng)對回腸粘膜CRF相關(guān)肽及其受體的表達情況進行動態(tài)觀察，進一步探討早期腸道營養(yǎng)的作用機制。 一、方法 1.采用

9、大鼠30％TBSAⅢ度燒傷模型，觀察第三腦室置管應(yīng)用CRFR1、CRFR2受體反義核酸及CRFR1、CRFR2受體特異拮抗劑對燒傷后第7天靜息能量消耗(REE)的影響，通過RT-PCR檢測應(yīng)用反義核酸后下丘腦CRFR1mRNA、CRFR2mRNA的表達變化，通過Westernblot檢測應(yīng)用反義核酸后下丘腦CRFR1、CRFR2蛋白表達變化。通過免疫組化及免疫熒光觀察應(yīng)用反義核酸燒傷后對下丘腦CRFR2表達變化情況。 2.建立大

10、鼠30％TBSAⅢ度燒傷早期腸道營養(yǎng)與靜脈營養(yǎng)模型，動物隨機分為正常對照組、早期腸道營養(yǎng)組和靜脈營養(yǎng)組，觀察燒傷后靜息能量消耗(REE)變化情況及早期腸道營養(yǎng)對燒傷高代謝反應(yīng)的影響。檢測傷后1、3、5、7天不同時相點血漿ACTH、CORT、CA及血清TNFα、IL-1β、IL-6的變化情況，檢測下丘腦CRFR2mRNA及蛋白表達變化。同時檢測下丘腦CRFmRNA、UCN1mRNA的變化情況。 3.建立大鼠30％TBsAⅢ度燒傷早

11、期腸道營養(yǎng)與靜脈營養(yǎng)模型，動物隨機分為正常對照組、早期腸道營養(yǎng)組和靜脈營養(yǎng)組，觀察燒傷后回腸粘膜層CRFR1、CRFR2受體mRNA及蛋白水平表達的變化情況，以及早期腸道營養(yǎng)對回腸CRFR1、CRFR2受體表達的影響。同時觀察燒傷后回腸粘膜層CRFmRNA、UCN1mRNA水平表達變化情況，以及早期腸道營養(yǎng)對回腸CRFmRNA、UCN1mRNA表達的影響。通過免疫組化檢測分析回腸粘膜層CRFR1、CRFR2受體的表達情況。 二、

12、結(jié)果 1.與CRFR2ODN組比較，CRFR2ASODN可明顯降低燒傷靜息能量消耗(REE)，與CRFR1ODN組比較，CRFR1ASODN無明顯降低燒傷高代謝反應(yīng)作用。Astressin2-B可明顯降低嚴重燒傷高代謝反應(yīng)，Antalarmin未見明顯降低燒傷高代謝反應(yīng)作用。CRFR1ASODN、CRFR2ASODN明顯下調(diào)嚴重燒傷大鼠下丘腦CRFR1mRNA、CRFR2mRNA及蛋白水平表達。 2.燒傷后REE均呈逐漸

13、增高的趨勢，EN組REE在傷后第3、5、7天明顯低于PN組(P＜0.05)。血漿ACTH、CORT燒傷后均明顯增高，傷后第三天以后逐漸下降，EN組在傷后第3、5天明顯低于PN組(P＜0.05)。血漿兒茶酚胺(CA)濃度傷后第1天最高，以后逐漸下降，EN組在傷后第3、5天明顯低于PN組(P＜0.05)。燒傷后血清腫瘤壞死因子(TNFα)、IL-1β、IL-6濃度呈逐漸升高趨勢，EN組在傷后第3、5、7天明顯低于PN組(P＜0.05)。

14、 3.燒傷后下丘腦CRFR2mRNA及蛋白表達均呈明顯增加趨勢，EN組下丘腦CRFR2mRNA及蛋白的表達在傷后第5、7天明顯低于PN組。燒傷后下丘腦CRFmRNA及蛋白表達呈下降趨勢，在傷后第三天降低至最低，以后逐漸回升，EN組下丘腦CRFmRNA及蛋白表達在傷后第3、5、7天明顯高于PN組。燒傷后下丘腦UCN1mRNA的表達呈逐漸增高趨勢，EN組下丘腦UCN1mRNA的表達在傷后第5、7天明顯低于PN組。 4.正常大鼠回

15、腸粘膜層均有CRFmRNA、UCN1mRNA、CRFR1mRNA、CRFR2mRNA表達，燒傷后CRFmRNA、UCN1mRNA、CRFR1mRNA、CRFR2mRNA表達明顯增加，早期腸道營養(yǎng)可下調(diào)回腸粘膜CRFmRNA、CRFR1mRNA和蛋白的表達，增加UCN1mRNA、CRFR2mRNA和蛋白的表達。 5.免疫組化結(jié)果顯示正常大鼠回腸肌間神經(jīng)叢、粘膜下神經(jīng)叢、粘膜層均有CRFR1、CRFR2表達，燒傷后CRFR1、CRF

16、R2表達明顯增加，早期腸道營養(yǎng)可下調(diào)回腸粘膜CRFR1的表達，增加CRFR2的表達。 三、結(jié)論 1.下丘腦CRFR2受體可能參與嚴重燒傷大鼠高代謝反應(yīng)調(diào)節(jié)，CRFR1受體在燒傷高代謝反應(yīng)中作用可能不是主要的。 2.早期腸道營養(yǎng)可減低嚴重燒傷大鼠高代謝反應(yīng)，可能通過降低燒傷大鼠血漿ACTH、CORT、兒茶酚胺、血清TNFα、IL-1β、IL-6濃度起作用。 3.早期腸道營養(yǎng)下調(diào)下丘腦CRFR2mRNA及蛋白