?；撬釋乐責齻缙谛募p傷相關基因表達調控的研究.pdf

1、牛磺酸(Tau)是心肌中含量最豐富的游離氨基酸，具有抗炎和抗氧化等作用，是一種很好的內源性細胞保護劑。本課題組就?；撬釋π募〉谋Ｗo作用進行了系列研究，研究發(fā)現(xiàn)：①?；撬崮芙档蜔齻笫笮募『脱獫{中TNF-α，從而降低炎癥反應；②?；撬崮芮宄杂苫{節(jié)胞內鈣穩(wěn)態(tài)，對心肌線粒體結構功能損傷有明顯保護作用；③?；撬崮苷{節(jié)凋亡相關基因表達而降低心肌細胞凋亡。為深入探討?；撬釋乐責齻缙谛募p傷相關基因表達及其信號轉導通路的影響，本課題設計通過

2、細胞水平、分子生物學水平、動物實驗三個層面，在以往的研究基礎上，深入了解?；撬峥剐募〖毎装Y/凋亡損傷、保護心肌細胞的作用及可能機制。該研究的完成可拓寬?；撬嵩谂R床上的應用，且可為嚴重燒傷早期如何保護心臟，減少心肌損害及恢復心功能提供新的思路和途徑，推動燒傷后心肌損害防治藥物的研究開發(fā)與應用。 第一部分：體外研究?；撬釋π募〖毎麚p傷相關基因表達調控的研究 目的：在缺氧復合燒傷血清作用的心肌細胞上，觀察不同缺氧時間段，HI

3、F-1α、p38激酶、GRP94基因表達的變化及其與肌鈣蛋白、TNF-α水平的相關性，并同時觀察牛磺酸的影響。對比觀察p38激酶抑制劑(SB203580)及?；撬釋IF-1α基因表達的影響。試圖闡明燒傷后心肌細胞炎癥/凋亡相關基因表達與心肌損傷的影響，闡明?；撬釋齻筮@些相關基因表達與釋放的調控機制及其在相關的細胞信號轉導途徑的作用位點，深入研究?；撬岜Ｗo燒傷后心肌細胞的作用機制方法： 新生乳鼠原代心肌細胞由胰酶消化法獲得，

4、本部分實驗主要為： 1、建立缺氧復合燒傷血清心肌細胞損傷模型：實驗分為常氧培養(yǎng)組、單純缺氧組、缺氧復合燒傷血清組。觀察本實驗設計的缺氧復合燒傷血清培養(yǎng)心肌細胞在缺氧1h、3h、6h、12h、24h五個時間點心肌細胞損傷的情況：倒置相差顯微鏡下觀測各組心肌細胞搏動的頻率和節(jié)律，用ELISA法測定各時相細胞培養(yǎng)液心肌肌鈣蛋白，并與單純缺氧及常氧培養(yǎng)的細胞對比，以確立缺氧復合燒傷血清刺激心肌細胞的損傷程度，建立缺氧復合燒傷血清培養(yǎng)心肌

5、細胞損傷模型。 2、研究相關基因的表達變化與心肌細胞損傷的關系及?；撬岬挠绊懀簩嶒灧纸M為：缺氧復合燒傷血清組、牛磺酸組、SB203580組、SB203580+?；撬峤M。對比觀察p38激酶抑制劑SB203580、牛磺酸、?；撬?SB203580對缺氧復合燒傷血清培養(yǎng)的心肌細胞搏動頻率和節(jié)律、細胞存活率(MTT法)等的影響；用RT-PCR檢測HIF-1α、p38激酶、GRP94的mRNA水平，并用Western blot法半定量檢測

6、HIF-1α、p38激酶、磷酸化p38激酶水平，明確缺氧復合燒傷血清刺激心肌細胞時，這些基因的表達變化與心肌細胞損傷的關系及其牛磺酸的影響，同時觀察心肌細胞HIF-1α、p38激酶表達與TNF—α、心肌肌鈣蛋白的關系，試圖探討?；撬釋ρ装Y相關基因表達的具體作用環(huán)節(jié)。觀察?；撬釋RP94表達的影響，初步探討牛磺酸對燒傷后心肌細胞內質網(wǎng)應激相關基因的影響。 結果： 1、單純缺氧培養(yǎng)1h心肌細胞搏動頻率加快、強度增強；缺氧3

7、h搏動頻率減慢，節(jié)律較整齊；缺氧6h大多數(shù)細胞搏動淺慢，節(jié)律不整齊；缺氧12h絕大多數(shù)細胞已無搏動，極少數(shù)淺慢搏動，細胞貼壁較好；缺氧24h有較少的存活細胞，培養(yǎng)液心肌肌鈣蛋白水平在缺氧3h以后即有顯著性升高，提示心肌細胞出現(xiàn)損傷性改變。缺氧復合燒傷血清培養(yǎng)的心肌細胞缺氧1h、3h搏動頻率與單純缺氧類似；但缺氧6h細胞搏動頻率及強度明顯下降；缺氧12h絕大多數(shù)細胞無搏動，有少數(shù)細胞脫落，大多數(shù)細胞貼壁較差；缺氧24h無存活細胞；心肌肌鈣

8、蛋白水平缺氧3h后各時相點均比單純缺氧組高，提示缺氧復合燒傷血清培養(yǎng)心肌細胞比單純缺氧培養(yǎng)的心肌細胞損傷嚴重，即建立缺氧復合燒傷血清培養(yǎng)心肌細胞損傷模型。為便于研究出發(fā)，缺氧復合燒傷血清心肌細胞培養(yǎng)合適的缺氧時相為：1h、3h、6h、12h。 2、缺氧復合燒傷血清組HIF-1α、p38激酶、GRP94表達在缺氧早期(1h)即上調，缺氧3h明顯增高，HIF-1α缺氧6h、12h為高峰；p38激酶6h達高值，12h表達量仍在高值；G

9、RP94基因表達缺氧12h達高值，培養(yǎng)液肌鈣蛋白水平、TNF-α水平與上述基因的表達呈正相關，提示這些基因在燒傷后心肌細胞應激起著一定的作用，持續(xù)高表達啟動心肌炎癥反應引起心肌的嚴重損傷。 3、?；撬峤M各時相心肌細胞搏動頻率與缺氧復合血清培養(yǎng)心肌細胞相比較，除缺氧1h相似之外，其余時相心肌細胞搏動頻率、強度均比單純缺氧復合燒傷血清培養(yǎng)心肌細胞快和強度大，缺氧12h存活細胞明顯增多，而培養(yǎng)液心肌肌鈣蛋白水平、TNF-α則較后者低，

10、HIF-1α、p38激酶蛋白水平降低，提示?；撬釋π募〖毎Ｗo作用與HIF-1α、p38激酶表達相關。 4、p38激酶抑制劑SB203580與單?；撬峤M在細胞搏動頻率及培養(yǎng)液肌鈣蛋白水平、TNF-α水平、HIF-1α、磷酸化p38激酶的蛋白水平無明顯差異，而SB203580+牛磺酸組與上述兩組有明顯差別，提示?；撬嵊修卓筽38激酶活性，并且可能是影響HIF-1α的活性的原因。 5、半定量RT-PCR檢測結果顯示，?；撬峤M

11、細胞較缺氧復合燒傷血清培養(yǎng)心肌細胞GRP94的表達量有顯著性下降。提示?；撬嵯抡{燒傷后內質網(wǎng)應激相關基因的表達。 結論： 1、燒傷后的心肌細胞損傷不單純是由于缺氧所致，燒傷早期血清存在著損傷心肌細胞的成分并且是燒傷后心肌細胞損傷的原因之一。 2、炎癥損傷是心肌損傷的重要原因，心肌細胞的本身是炎癥的策源地。 3、在體外缺氧復合燒傷血清培養(yǎng)的原代心肌細胞損傷模型上，證明了炎癥因子釋放相關的HIF-1α、P38

12、激酶基因持續(xù)高表達是燒傷后心肌細胞損傷的因素。 4、初步證明了內質網(wǎng)應激相關基因GRP94表達參與了燒傷后心肌細胞的損傷過程，其持續(xù)高表達是燒傷后是心肌細胞損傷的因素。 5、?；撬峥上抡{上述基因的表達，下調p38激酶的表達主要在翻譯后水平，下調HIF-1α表達的機制可能是通過拮抗p38激酶活性，影響MAPK級聯(lián)信號通路中p38途徑。 第二部分：體內研究?；撬釋荣|網(wǎng)應激介導大鼠燒傷后心肌損傷相關基因表達的影響

13、 目的:近年國內外學者重視內質網(wǎng)應激(ERS)的研究，但內質網(wǎng)應激參與心肌缺血/再灌注損傷的研究相對較少，特別是探討內質網(wǎng)應激與燒傷后心肌細胞損傷的研究尚未見報道。燒傷后心肌細胞ERS特點，牛磺酸對嚴重燒傷后心肌細胞ERS有何影響尚未見報道。本實驗探討嚴重燒傷后心肌細胞的ERS特點、過度ERS與心肌細胞損傷的關系、觀察心肌細胞損傷時內質網(wǎng)應激蛋白表達的改變及牛磺酸對其影響的分子機制，為?；撬嵩跓齻募p害防治中的應用提供了實驗依據(jù)。

14、 方法: 1.建立大鼠30％TBSAⅢ度燙(燒)傷動物模型。 2.HE染色普通光學顯微鏡觀察燒傷后及?；撬嶂委熀笮募〗M織形態(tài)變化。 3.用放射免疫和酶聯(lián)免疫法觀測燒傷大鼠在傷后血漿和心肌中cTnT、TNFα含量的變化及牛磺酸的影響。 4.用免疫組織化學方法分析大鼠心肌NF-KB、MAPKp38蛋白表達情況。 5.RT-PCR測定GRP94、caspase-12基因的表達變化。 結果

15、: 1.通過HE染色觀察發(fā)現(xiàn)燒傷后心肌組織嚴重損傷，經(jīng)?；撬嶂委熀髶p傷減輕。 2.放射免疫和酶聯(lián)免疫法觀測發(fā)現(xiàn)燒傷后血漿和心肌中cTnT、TNFα含量上升，?；撬嶂委熀髢芍笜撕肯陆怠?3.免疫組化分析表明：燒傷后NF-KB、MAPKp38迅速增加，傷后6h達峰值，傷后24h仍高于對照組。?；撬嶂委熃M心肌NF-κB，MAPKp38水平較燒傷組有顯著性降低。 4.半定量RT-PCR檢測結果顯示，燒傷1h后GRP94

16、、Caspase-12的較對照組有所升高，12h后達高峰，而牛磺酸治療組兩基因的表達量較燒傷組有顯著性下降。 結論: 1.嚴重燒傷后心肌GRP94和Caspase-12表達明顯升高，表明嚴重燒傷后心肌存在內質網(wǎng)應激反應，且內質網(wǎng)應激參與了燒傷后心肌損傷。 2.?；撬釋乐責齻髢荣|網(wǎng)應激介導的心肌損傷具有較好的保護作用，其分子機制主要是通過下調GRP94及內質網(wǎng)相關性死亡途徑中Caspase-12的表達及其活性等