?；撬釋?yán)重?zé)齻缙谛募p傷相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的研究.pdf

1、?；撬?Tau)是心肌中含量最豐富的游離氨基酸，具有抗炎和抗氧化等作用，是一種很好的內(nèi)源性細(xì)胞保護(hù)劑。本課題組就?；撬釋π募〉谋Ｗo(hù)作用進(jìn)行了系列研究，研究發(fā)現(xiàn)：①?；撬崮芙档蜔齻笫笮募『脱獫{中TNF-α，從而降低炎癥反應(yīng)；②牛磺酸能清除自由基，調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，對心肌線粒體結(jié)構(gòu)功能損傷有明顯保護(hù)作用；③?；撬崮苷{(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因表達(dá)而降低心肌細(xì)胞凋亡。為深入探討牛磺酸對嚴(yán)重?zé)齻缙谛募p傷相關(guān)基因表達(dá)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，本課題設(shè)計(jì)通過

2、細(xì)胞水平、分子生物學(xué)水平、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)三個(gè)層面，在以往的研究基礎(chǔ)上，深入了解?；撬峥剐募〖?xì)胞炎癥/凋亡損傷、保護(hù)心肌細(xì)胞的作用及可能機(jī)制。該研究的完成可拓寬?；撬嵩谂R床上的應(yīng)用，且可為嚴(yán)重?zé)齻缙谌绾伪Ｗo(hù)心臟，減少心肌損害及恢復(fù)心功能提供新的思路和途徑，推動(dòng)燒傷后心肌損害防治藥物的研究開發(fā)與應(yīng)用。 第一部分：體外研究?；撬釋π募〖?xì)胞損傷相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的研究 目的：在缺氧復(fù)合燒傷血清作用的心肌細(xì)胞上，觀察不同缺氧時(shí)間段，HI

3、F-1α、p38激酶、GRP94基因表達(dá)的變化及其與肌鈣蛋白、TNF-α水平的相關(guān)性，并同時(shí)觀察?；撬岬挠绊?。對比觀察p38激酶抑制劑(SB203580)及?；撬釋IF-1α基因表達(dá)的影響。試圖闡明燒傷后心肌細(xì)胞炎癥/凋亡相關(guān)基因表達(dá)與心肌損傷的影響，闡明牛磺酸對燒傷后這些相關(guān)基因表達(dá)與釋放的調(diào)控機(jī)制及其在相關(guān)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用位點(diǎn)，深入研究?；撬岜Ｗo(hù)燒傷后心肌細(xì)胞的作用機(jī)制方法： 新生乳鼠原代心肌細(xì)胞由胰酶消化法獲得，

4、本部分實(shí)驗(yàn)主要為： 1、建立缺氧復(fù)合燒傷血清心肌細(xì)胞損傷模型：實(shí)驗(yàn)分為常氧培養(yǎng)組、單純?nèi)毖踅M、缺氧復(fù)合燒傷血清組。觀察本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的缺氧復(fù)合燒傷血清培養(yǎng)心肌細(xì)胞在缺氧1h、3h、6h、12h、24h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)心肌細(xì)胞損傷的情況：倒置相差顯微鏡下觀測各組心肌細(xì)胞搏動(dòng)的頻率和節(jié)律，用ELISA法測定各時(shí)相細(xì)胞培養(yǎng)液心肌肌鈣蛋白，并與單純?nèi)毖跫俺Ｑ跖囵B(yǎng)的細(xì)胞對比，以確立缺氧復(fù)合燒傷血清刺激心肌細(xì)胞的損傷程度，建立缺氧復(fù)合燒傷血清培養(yǎng)心肌

5、細(xì)胞損傷模型。 2、研究相關(guān)基因的表達(dá)變化與心肌細(xì)胞損傷的關(guān)系及?；撬岬挠绊懀簩?shí)驗(yàn)分組為：缺氧復(fù)合燒傷血清組、?；撬峤M、SB203580組、SB203580+?；撬峤M。對比觀察p38激酶抑制劑SB203580、?；撬帷⑴；撬?SB203580對缺氧復(fù)合燒傷血清培養(yǎng)的心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率和節(jié)律、細(xì)胞存活率(MTT法)等的影響；用RT-PCR檢測HIF-1α、p38激酶、GRP94的mRNA水平，并用Western blot法半定量檢測

6、HIF-1α、p38激酶、磷酸化p38激酶水平，明確缺氧復(fù)合燒傷血清刺激心肌細(xì)胞時(shí)，這些基因的表達(dá)變化與心肌細(xì)胞損傷的關(guān)系及其?；撬岬挠绊?，同時(shí)觀察心肌細(xì)胞HIF-1α、p38激酶表達(dá)與TNF—α、心肌肌鈣蛋白的關(guān)系，試圖探討?；撬釋ρ装Y相關(guān)基因表達(dá)的具體作用環(huán)節(jié)。觀察牛磺酸對GRP94表達(dá)的影響，初步探討?；撬釋齻笮募〖?xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的影響。 結(jié)果： 1、單純?nèi)毖跖囵B(yǎng)1h心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率加快、強(qiáng)度增強(qiáng)；缺氧3

7、h搏動(dòng)頻率減慢，節(jié)律較整齊；缺氧6h大多數(shù)細(xì)胞搏動(dòng)淺慢，節(jié)律不整齊；缺氧12h絕大多數(shù)細(xì)胞已無搏動(dòng)，極少數(shù)淺慢搏動(dòng)，細(xì)胞貼壁較好；缺氧24h有較少的存活細(xì)胞，培養(yǎng)液心肌肌鈣蛋白水平在缺氧3h以后即有顯著性升高，提示心肌細(xì)胞出現(xiàn)損傷性改變。缺氧復(fù)合燒傷血清培養(yǎng)的心肌細(xì)胞缺氧1h、3h搏動(dòng)頻率與單純?nèi)毖躅愃疲坏毖?h細(xì)胞搏動(dòng)頻率及強(qiáng)度明顯下降；缺氧12h絕大多數(shù)細(xì)胞無搏動(dòng)，有少數(shù)細(xì)胞脫落，大多數(shù)細(xì)胞貼壁較差；缺氧24h無存活細(xì)胞；心肌肌鈣

8、蛋白水平缺氧3h后各時(shí)相點(diǎn)均比單純?nèi)毖踅M高，提示缺氧復(fù)合燒傷血清培養(yǎng)心肌細(xì)胞比單純?nèi)毖跖囵B(yǎng)的心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重，即建立缺氧復(fù)合燒傷血清培養(yǎng)心肌細(xì)胞損傷模型。為便于研究出發(fā)，缺氧復(fù)合燒傷血清心肌細(xì)胞培養(yǎng)合適的缺氧時(shí)相為：1h、3h、6h、12h。 2、缺氧復(fù)合燒傷血清組HIF-1α、p38激酶、GRP94表達(dá)在缺氧早期(1h)即上調(diào)，缺氧3h明顯增高，HIF-1α缺氧6h、12h為高峰；p38激酶6h達(dá)高值，12h表達(dá)量仍在高值；G

9、RP94基因表達(dá)缺氧12h達(dá)高值，培養(yǎng)液肌鈣蛋白水平、TNF-α水平與上述基因的表達(dá)呈正相關(guān)，提示這些基因在燒傷后心肌細(xì)胞應(yīng)激起著一定的作用，持續(xù)高表達(dá)啟動(dòng)心肌炎癥反應(yīng)引起心肌的嚴(yán)重?fù)p傷。 3、?；撬峤M各時(shí)相心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率與缺氧復(fù)合血清培養(yǎng)心肌細(xì)胞相比較，除缺氧1h相似之外，其余時(shí)相心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率、強(qiáng)度均比單純?nèi)毖鯊?fù)合燒傷血清培養(yǎng)心肌細(xì)胞快和強(qiáng)度大，缺氧12h存活細(xì)胞明顯增多，而培養(yǎng)液心肌肌鈣蛋白水平、TNF-α則較后者低，

10、HIF-1α、p38激酶蛋白水平降低，提示?；撬釋π募〖?xì)胞保護(hù)作用與HIF-1α、p38激酶表達(dá)相關(guān)。 4、p38激酶抑制劑SB203580與單?；撬峤M在細(xì)胞搏動(dòng)頻率及培養(yǎng)液肌鈣蛋白水平、TNF-α水平、HIF-1α、磷酸化p38激酶的蛋白水平無明顯差異，而SB203580+?；撬峤M與上述兩組有明顯差別，提示?；撬嵊修卓筽38激酶活性，并且可能是影響HIF-1α的活性的原因。 5、半定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，?；撬峤M

11、細(xì)胞較缺氧復(fù)合燒傷血清培養(yǎng)心肌細(xì)胞GRP94的表達(dá)量有顯著性下降。提示牛磺酸下調(diào)燒傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)。 結(jié)論： 1、燒傷后的心肌細(xì)胞損傷不單純是由于缺氧所致，燒傷早期血清存在著損傷心肌細(xì)胞的成分并且是燒傷后心肌細(xì)胞損傷的原因之一。 2、炎癥損傷是心肌損傷的重要原因，心肌細(xì)胞的本身是炎癥的策源地。 3、在體外缺氧復(fù)合燒傷血清培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞損傷模型上，證明了炎癥因子釋放相關(guān)的HIF-1α、P38

12、激酶基因持續(xù)高表達(dá)是燒傷后心肌細(xì)胞損傷的因素。 4、初步證明了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因GRP94表達(dá)參與了燒傷后心肌細(xì)胞的損傷過程，其持續(xù)高表達(dá)是燒傷后是心肌細(xì)胞損傷的因素。 5、?；撬峥上抡{(diào)上述基因的表達(dá)，下調(diào)p38激酶的表達(dá)主要在翻譯后水平，下調(diào)HIF-1α表達(dá)的機(jī)制可能是通過拮抗p38激酶活性，影響MAPK級聯(lián)信號通路中p38途徑。 第二部分：體內(nèi)研究?；撬釋?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)大鼠燒傷后心肌損傷相關(guān)基因表達(dá)的影響

13、 目的:近年國內(nèi)外學(xué)者重視內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)的研究，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與心肌缺血/再灌注損傷的研究相對較少，特別是探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與燒傷后心肌細(xì)胞損傷的研究尚未見報(bào)道。燒傷后心肌細(xì)胞ERS特點(diǎn)，?；撬釋?yán)重?zé)齻笮募〖?xì)胞ERS有何影響尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探討嚴(yán)重?zé)齻笮募〖?xì)胞的ERS特點(diǎn)、過度ERS與心肌細(xì)胞損傷的關(guān)系、觀察心肌細(xì)胞損傷時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白表達(dá)的改變及牛磺酸對其影響的分子機(jī)制，為牛磺酸在燒傷心肌損害防治中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

14、 方法: 1.建立大鼠30％TBSAⅢ度燙(燒)傷動(dòng)物模型。 2.HE染色普通光學(xué)顯微鏡觀察燒傷后及牛磺酸治療后心肌組織形態(tài)變化。 3.用放射免疫和酶聯(lián)免疫法觀測燒傷大鼠在傷后血漿和心肌中cTnT、TNFα含量的變化及?；撬岬挠绊?。 4.用免疫組織化學(xué)方法分析大鼠心肌NF-KB、MAPKp38蛋白表達(dá)情況。 5.RT-PCR測定GRP94、caspase-12基因的表達(dá)變化。 結(jié)果

15、: 1.通過HE染色觀察發(fā)現(xiàn)燒傷后心肌組織嚴(yán)重?fù)p傷，經(jīng)牛磺酸治療后損傷減輕。 2.放射免疫和酶聯(lián)免疫法觀測發(fā)現(xiàn)燒傷后血漿和心肌中cTnT、TNFα含量上升，?；撬嶂委熀髢芍笜?biāo)含量下降。 3.免疫組化分析表明：燒傷后NF-KB、MAPKp38迅速增加，傷后6h達(dá)峰值，傷后24h仍高于對照組。?；撬嶂委熃M心肌NF-κB，MAPKp38水平較燒傷組有顯著性降低。 4.半定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，燒傷1h后GRP94

16、、Caspase-12的較對照組有所升高，12h后達(dá)高峰，而?；撬嶂委熃M兩基因的表達(dá)量較燒傷組有顯著性下降。 結(jié)論: 1.嚴(yán)重?zé)齻笮募RP94和Caspase-12表達(dá)明顯升高，表明嚴(yán)重?zé)齻笮募〈嬖趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了燒傷后心肌損傷。 2.?；撬釋?yán)重?zé)齻髢?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的心肌損傷具有較好的保護(hù)作用，其分子機(jī)制主要是通過下調(diào)GRP94及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性死亡途徑中Caspase-12的表達(dá)及其活性等