膠原基含糖半互穿網(wǎng)絡(luò)聚合角膜替代物體內(nèi)外生物相容性研究.pdf

1、研究目的:
　　評(píng)價(jià)膠原基含糖半互穿網(wǎng)絡(luò)角膜替代物在體外以及兔角膜組織中的生物相容性，以探討其作為角膜支架材料的可行性。
　　方法:
　　第一部分：體外生物相容性研究，選擇中國(guó)大耳白兔1只，雌雄不限，2.0-2.5kg，由天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，排除角膜疾患。膠原基含糖半互穿網(wǎng)絡(luò)角膜替代物材料由天津大學(xué)材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院提供。材料性能：直徑12mm，厚度300μm，白光透過率90％以上，平衡含水量90％以上，

2、抗張強(qiáng)度0.6±0.1mpa，體外膠原酶(12微克/毫升)降解試驗(yàn)，30小時(shí)內(nèi)剩余質(zhì)量在40％以上。取材：速眠新(靜松靈、乙二胺四乙酸(EDTA)、鹽酸二氫埃托啡和氟哌啶醇的復(fù)方制劑)和氯胺酮進(jìn)行肌肉注射麻醉，兔眼周圍予以清潔消毒鋪巾，開瞼器開眼，抗生素鹽水沖洗結(jié)膜囊，在顯微鏡下用隧道刀對(duì)角膜緣上皮進(jìn)行剖切，剪下角膜緣上皮組織，再剪成1mm×1mm大小的組織塊均勻鋪于膠原基含糖半互穿網(wǎng)絡(luò)聚合角膜替代材料及半透膜上。倒置顯微鏡對(duì)體外構(gòu)建的

3、角膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)速度，形態(tài)等進(jìn)行觀察，兩周后將培養(yǎng)細(xì)胞行蘇木精-伊紅(HE)染色。
　　第二部分：體內(nèi)生物相容性研究，實(shí)驗(yàn)組48眼，單眼前板層植入膠原基含糖半互穿網(wǎng)絡(luò)角膜替代物材料，對(duì)照組48眼行同種異體角膜前板層移植，其余24只白兔為板層角膜供體。角膜移植術(shù)后3天、7天、15天、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月進(jìn)行肉眼及裂隙燈觀察，觀察內(nèi)容包括：角膜透明度及新生血管情況，術(shù)后3天、7天、15天、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月分別處死每組動(dòng)物中的8

4、只，術(shù)眼固定于10％甲醛溶液中，行HE染色在光鏡下進(jìn)行兔角膜組織病理學(xué)觀察及上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白K3的免疫組化檢測(cè)。評(píng)分結(jié)果采用Wileoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)判斷實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在角膜透明度及新生血管情況方面有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　第一部分
　　1.倒置顯微鏡觀察，5天左右組織塊細(xì)胞向周圍融合成單層，細(xì)胞呈膜狀生長(zhǎng)，生長(zhǎng)界限明顯，成沙灘樣外觀，細(xì)胞間相互緊密連接，接近組織塊的區(qū)域可呈復(fù)層生長(zhǎng)，持續(xù)培養(yǎng)2周，細(xì)胞呈復(fù)層

5、生長(zhǎng)。氣液界面培養(yǎng)可以形成連續(xù)的上皮細(xì)胞層，細(xì)胞和載體之間連接較牢固。
　　2.HE染色顯示體外構(gòu)建的角膜上皮具有復(fù)層扁平上皮的結(jié)構(gòu)。
　　第二部分
　　1.術(shù)后實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組角膜透明度逐漸升高，術(shù)后3天、7天、15天兩組透明度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，術(shù)后1個(gè)月、3個(gè)月及6個(gè)月與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　2.實(shí)驗(yàn)組角膜新生血管評(píng)分在術(shù)后3天，7天、15天、1個(gè)月隨時(shí)間延長(zhǎng)逐

6、漸升高，至術(shù)后1個(gè)月達(dá)最高，后逐漸降低。對(duì)照組角膜新生血管評(píng)分在術(shù)后3天7天、15天逐漸升高，術(shù)后15天達(dá)到最高，后逐漸減退。統(tǒng)計(jì)分析顯示，兩組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)角膜新生血管評(píng)分比較，術(shù)后3天及術(shù)后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.術(shù)后3天，實(shí)驗(yàn)組角膜中央上皮層大部分缺損，周邊上皮正在向中央生長(zhǎng)，均勻紅染的膠原物質(zhì)覆蓋表面，基質(zhì)層水腫，炎性細(xì)胞在植片與切口交界

7、處明顯。術(shù)后7天，角膜表面單層上皮細(xì)胞局部覆蓋，基質(zhì)層內(nèi)可見逐漸降解的膠原物質(zhì)，淺層基質(zhì)膠原纖維排列紊亂，并且大量成纖維細(xì)胞，散在少量淋巴細(xì)胞。術(shù)后15天，淺層基質(zhì)仍有較多的成纖維細(xì)胞，沉積的膠原纖維排列仍不規(guī)則。術(shù)后1個(gè)月，角膜上皮覆蓋完全，淺基質(zhì)層膠原纖維排列趨于規(guī)則，但仍較正?；|(zhì)紊亂。術(shù)后3個(gè)月，上皮修復(fù)良好，淺基質(zhì)層膠原纖維走行與下方膠原纖維排列趨于一致。至術(shù)后6個(gè)月，角膜上皮修復(fù)，膠原纖維排列規(guī)則，部分區(qū)域存在小的膠原紊亂區(qū)

8、。對(duì)照組術(shù)后3天，角膜上皮局部缺損，淺基質(zhì)水腫明顯，成纖維細(xì)胞略有增加。術(shù)后7天角膜上皮修復(fù)良好，基質(zhì)水腫減輕，成纖維細(xì)胞數(shù)量增加較明顯。術(shù)后15天，上皮完整，基質(zhì)層膠原纖維排列基本規(guī)則，成纖維細(xì)胞數(shù)量有所減少。術(shù)后1個(gè)月，膠原纖維排列趨于一致，局部欠規(guī)則。術(shù)后3個(gè)月及6個(gè)月，細(xì)胞層次清楚，基質(zhì)層膠原排列規(guī)則。
　　4.免疫組化顯示術(shù)后6個(gè)月角膜上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白K3檢測(cè)為陽(yáng)性表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　膠原基含糖半互