超分子聚合物水凝膠角膜基質(zhì)替代物體內(nèi)體外生物相容性研究.pdf

1、目的：
　　1、體外構(gòu)建超分子聚合物水凝膠，檢測其生物性能和機(jī)械性能。
　　2、通過研究超分子聚合物水凝膠在生物體內(nèi)外的相容性，探討其作為角膜基質(zhì)替代物材料的可行性，為超分子聚合物水凝膠角膜基質(zhì)替代物的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法：
　　一、體外生物相容性實(shí)驗(yàn)研究
　　1.兔角膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定。
　　2.將兔角膜上皮細(xì)胞接種到超分子聚合物（PNAGA）水凝膠上，顯微鏡下觀察角膜上皮細(xì)胞生長情況

2、，并利用LIVE-DEAD細(xì)胞活性毒性檢測試劑盒檢測細(xì)胞活性。
　　二、體內(nèi)生物相容性實(shí)驗(yàn)研究
　　1.將PNAGA水凝膠移植到活體兔軟骨中，12周后處死兔子，取兔子軟骨做蘇木素－伊紅(hematoxylin-eosin staining；HE)染色，觀察水凝膠與兔軟骨的生物相容性和炎癥反應(yīng)。
　　2.將PNAGA水凝膠角膜基質(zhì)替代物移植到活體兔角膜上，選取右眼為手術(shù)眼，左眼作為正常對照。實(shí)驗(yàn)采用兩種手術(shù)方式將水凝膠角

3、膜基質(zhì)替代物植入術(shù)眼，即板層移植和角膜層間移植。分別于術(shù)后1天、3天、7天、15天、1月、3月進(jìn)行肉眼和裂隙燈觀察兔眼角膜有無免疫排斥反應(yīng)，記錄角膜透明度、角膜新生血管、角膜上皮化、植片水腫及結(jié)膜充血情況；于術(shù)后15天、3月行兔眼角膜共聚焦顯微鏡檢查，觀察角膜上皮生長情況和角膜內(nèi)皮數(shù)量的變化，觀察是否有細(xì)胞長入到水凝膠內(nèi)；分別于術(shù)后1月、3月處死兔子，取兔子眼球行角膜蘇木素－伊紅(hematoxylin-eosin staining；H

4、E)染色和角膜上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白CK3抗體AE5免疫組織化學(xué)檢測。
　　結(jié)果：
　　1．成功分離培養(yǎng)兔角膜上皮細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果為陽性，表明該細(xì)胞為角膜上皮細(xì)胞。角膜上皮細(xì)胞在PNAGA水凝膠上生長狀態(tài)良好，細(xì)胞連接緊密。細(xì)胞活性毒性檢測結(jié)果顯示兔角膜上皮細(xì)胞在PNAGA水凝膠上存活率基本達(dá)100％，表明細(xì)胞具有良好的活性，PNAGA水凝膠無細(xì)胞毒性。
　　2．12周后水凝膠在兔子軟骨內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定，沒有引起周

5、圍組織的炎癥反應(yīng)，也沒有與周圍軟骨組織融合在一起。未放入水凝膠的軟骨缺損組織已經(jīng)愈合。
　　3．將PNAGA水凝膠移植到兔眼角膜，板層移植及角膜層間移植術(shù)后角膜及植片均保持透明，沒有出現(xiàn)角膜潰瘍和混濁，虹膜紋理及瞳孔清晰可見，無結(jié)膜充血情況，植片無水腫。角膜層間移植術(shù)后1月，可見有細(xì)小新生血管從植片上方爬到植片邊緣。術(shù)后3月，新生血管繼續(xù)生長，但僅為植片上方小部分。熒光素鈉染色角膜，板層移植角膜植片部位全部著染，術(shù)后一直無角膜上皮

6、細(xì)胞生長到PNAGA水凝膠角膜基質(zhì)替代物表面。角膜層間移植僅切口部位輕微著染，無明顯角膜上皮缺損。
　　4．共聚焦顯微鏡觀察板層移植術(shù)后，水凝膠表面沒有角膜上皮細(xì)胞生長，上皮細(xì)胞通過植片與角膜組織間的縫隙爬到植片下面，在手術(shù)形成的角膜基質(zhì)剖切面上重新角膜上皮化愈合，角膜上皮細(xì)胞生長良好，細(xì)胞間連接緊密。角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目變化無統(tǒng)計學(xué)意義。角膜層間移植術(shù)后，角膜上皮細(xì)胞沒有出現(xiàn)明顯的上皮細(xì)胞死亡及上皮細(xì)胞大片缺損。角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目變化

7、無統(tǒng)計學(xué)意義。角膜基質(zhì)中，在水凝膠下面的角膜基質(zhì)上有角膜上皮細(xì)胞生長，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，彼此間連接緊密。
　　5． HE染色PNAGA水凝膠呈紫色均勻物質(zhì)，表面和內(nèi)部無細(xì)胞生長，PNAGA水凝膠與周圍角膜組織處于彼此分離的狀態(tài)，角膜組織無明顯水腫以及炎癥細(xì)胞浸潤。植片下面角膜組織表面已經(jīng)上皮化修復(fù)，細(xì)胞呈矮柱狀整齊排列，角膜層間移植術(shù)后，可見基質(zhì)內(nèi)水凝膠下面的角膜組織表面已經(jīng)上皮化修復(fù)，細(xì)胞形態(tài)正常且整齊排列。
　　6．角膜

8、上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白CK3抗體AE5免疫組織化學(xué)檢測，板層移植術(shù)后1月及3月，可見PNAGA水凝膠角膜基質(zhì)替代物下方的角膜組織上已經(jīng)上皮化修復(fù)，細(xì)胞形態(tài)正常且整齊排列。角膜層間移植術(shù)后1月及3月，可見基質(zhì)內(nèi)水凝膠下面的角膜組織表面已經(jīng)上皮化修復(fù)，細(xì)胞形態(tài)正常且整齊排列。
　　結(jié)論：
　　1．實(shí)驗(yàn)所用超分子聚合物水凝膠的成分為多聚丙烯?；拾滨０罚≒oly N-acryloyl glycinamide，PNAGA），是甘氨酸

9、的衍生物，結(jié)構(gòu)簡單不含交聯(lián)劑。PNAGA水凝膠材料具有許多優(yōu)點(diǎn)。
　　2．研究采用組織塊細(xì)胞培養(yǎng)法，可獲得形態(tài)及性狀穩(wěn)定的兔角膜上皮細(xì)胞。同時細(xì)胞活性毒性檢測顯示細(xì)胞在PNAGA水凝膠存活率基本達(dá)100%，說明PNAGA水凝膠不會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性反應(yīng)。PNAGA水凝膠體外生物相容性良好，為其在動物實(shí)驗(yàn)體內(nèi)相容性的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　3． PNAGA水凝膠首次作為角膜基質(zhì)替代物材料應(yīng)用在角膜上，它的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)都非常穩(wěn)定