超分子聚合物水凝膠角膜基質(zhì)替代物體內(nèi)體外生物相容性研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  1、體外構(gòu)建超分子聚合物水凝膠,檢測其生物性能和機械性能。
  2、通過研究超分子聚合物水凝膠在生物體內(nèi)外的相容性,探討其作為角膜基質(zhì)替代物材料的可行性,為超分子聚合物水凝膠角膜基質(zhì)替代物的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
  方法:
  一、體外生物相容性實驗研究
  1.兔角膜上皮細胞原代培養(yǎng)及鑒定。
  2.將兔角膜上皮細胞接種到超分子聚合物(PNAGA)水凝膠上,顯微鏡下觀察角膜上皮細胞生長情況

2、,并利用LIVE-DEAD細胞活性毒性檢測試劑盒檢測細胞活性。
  二、體內(nèi)生物相容性實驗研究
  1.將PNAGA水凝膠移植到活體兔軟骨中,12周后處死兔子,取兔子軟骨做蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin staining;HE)染色,觀察水凝膠與兔軟骨的生物相容性和炎癥反應(yīng)。
  2.將PNAGA水凝膠角膜基質(zhì)替代物移植到活體兔角膜上,選取右眼為手術(shù)眼,左眼作為正常對照。實驗采用兩種手術(shù)方式將水凝膠角

3、膜基質(zhì)替代物植入術(shù)眼,即板層移植和角膜層間移植。分別于術(shù)后1天、3天、7天、15天、1月、3月進行肉眼和裂隙燈觀察兔眼角膜有無免疫排斥反應(yīng),記錄角膜透明度、角膜新生血管、角膜上皮化、植片水腫及結(jié)膜充血情況;于術(shù)后15天、3月行兔眼角膜共聚焦顯微鏡檢查,觀察角膜上皮生長情況和角膜內(nèi)皮數(shù)量的變化,觀察是否有細胞長入到水凝膠內(nèi);分別于術(shù)后1月、3月處死兔子,取兔子眼球行角膜蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin staining;H

4、E)染色和角膜上皮細胞特異性標志蛋白CK3抗體AE5免疫組織化學檢測。
  結(jié)果:
  1.成功分離培養(yǎng)兔角膜上皮細胞,細胞免疫熒光鑒定結(jié)果為陽性,表明該細胞為角膜上皮細胞。角膜上皮細胞在PNAGA水凝膠上生長狀態(tài)良好,細胞連接緊密。細胞活性毒性檢測結(jié)果顯示兔角膜上皮細胞在PNAGA水凝膠上存活率基本達100%,表明細胞具有良好的活性,PNAGA水凝膠無細胞毒性。
  2.12周后水凝膠在兔子軟骨內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定,沒有引起周

5、圍組織的炎癥反應(yīng),也沒有與周圍軟骨組織融合在一起。未放入水凝膠的軟骨缺損組織已經(jīng)愈合。
  3.將PNAGA水凝膠移植到兔眼角膜,板層移植及角膜層間移植術(shù)后角膜及植片均保持透明,沒有出現(xiàn)角膜潰瘍和混濁,虹膜紋理及瞳孔清晰可見,無結(jié)膜充血情況,植片無水腫。角膜層間移植術(shù)后1月,可見有細小新生血管從植片上方爬到植片邊緣。術(shù)后3月,新生血管繼續(xù)生長,但僅為植片上方小部分。熒光素鈉染色角膜,板層移植角膜植片部位全部著染,術(shù)后一直無角膜上皮

6、細胞生長到PNAGA水凝膠角膜基質(zhì)替代物表面。角膜層間移植僅切口部位輕微著染,無明顯角膜上皮缺損。
  4.共聚焦顯微鏡觀察板層移植術(shù)后,水凝膠表面沒有角膜上皮細胞生長,上皮細胞通過植片與角膜組織間的縫隙爬到植片下面,在手術(shù)形成的角膜基質(zhì)剖切面上重新角膜上皮化愈合,角膜上皮細胞生長良好,細胞間連接緊密。角膜內(nèi)皮細胞數(shù)目變化無統(tǒng)計學意義。角膜層間移植術(shù)后,角膜上皮細胞沒有出現(xiàn)明顯的上皮細胞死亡及上皮細胞大片缺損。角膜內(nèi)皮細胞數(shù)目變化

7、無統(tǒng)計學意義。角膜基質(zhì)中,在水凝膠下面的角膜基質(zhì)上有角膜上皮細胞生長,細胞生長狀態(tài)良好,彼此間連接緊密。
  5. HE染色PNAGA水凝膠呈紫色均勻物質(zhì),表面和內(nèi)部無細胞生長,PNAGA水凝膠與周圍角膜組織處于彼此分離的狀態(tài),角膜組織無明顯水腫以及炎癥細胞浸潤。植片下面角膜組織表面已經(jīng)上皮化修復,細胞呈矮柱狀整齊排列,角膜層間移植術(shù)后,可見基質(zhì)內(nèi)水凝膠下面的角膜組織表面已經(jīng)上皮化修復,細胞形態(tài)正常且整齊排列。
  6.角膜

8、上皮細胞特異性標志蛋白CK3抗體AE5免疫組織化學檢測,板層移植術(shù)后1月及3月,可見PNAGA水凝膠角膜基質(zhì)替代物下方的角膜組織上已經(jīng)上皮化修復,細胞形態(tài)正常且整齊排列。角膜層間移植術(shù)后1月及3月,可見基質(zhì)內(nèi)水凝膠下面的角膜組織表面已經(jīng)上皮化修復,細胞形態(tài)正常且整齊排列。
  結(jié)論:
  1.實驗所用超分子聚合物水凝膠的成分為多聚丙烯?;拾滨0罚≒oly N-acryloyl glycinamide,PNAGA),是甘氨酸

9、的衍生物,結(jié)構(gòu)簡單不含交聯(lián)劑。PNAGA水凝膠材料具有許多優(yōu)點。
  2.研究采用組織塊細胞培養(yǎng)法,可獲得形態(tài)及性狀穩(wěn)定的兔角膜上皮細胞。同時細胞活性毒性檢測顯示細胞在PNAGA水凝膠存活率基本達100%,說明PNAGA水凝膠不會對細胞產(chǎn)生毒性反應(yīng)。PNAGA水凝膠體外生物相容性良好,為其在動物實驗體內(nèi)相容性的研究奠定了基礎(chǔ)。
  3. PNAGA水凝膠首次作為角膜基質(zhì)替代物材料應(yīng)用在角膜上,它的物理性質(zhì)和化學性質(zhì)都非常穩(wěn)定

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