階躍式微弧氧化鎂合金的體外生物相容性研究.pdf

1、隨著社會的發(fā)展，生物醫(yī)學(xué)材料在疾病的治療中發(fā)揮著不可替代的作用。在骨科領(lǐng)域，金屬材料的力學(xué)性能是其他材料所無法比擬的，鎂合金作為一種新型的生物醫(yī)學(xué)金屬材料以其獨(dú)特的優(yōu)勢引起人們越來越多的關(guān)注，它有以下優(yōu)點(diǎn)：資源豐富；比強(qiáng)度和比剛度高；密度及彈性模量均與人正常骨組織相近，可有效的緩解應(yīng)力遮擋效應(yīng)，促進(jìn)骨的生長和愈合。另外鎂是人體內(nèi)僅次于鈣、鈉和鉀的常量元素，參與體內(nèi)一系列新陳代謝過程。 然而，鎂及鎂合金最大的缺點(diǎn)就是它在體液中的耐

2、腐蝕性較差，能夠不斷的降解。國內(nèi)外學(xué)者通過各種方法來改變鎂合金表面的熱化學(xué)性質(zhì)，增加其耐腐蝕性，如堿處理、熱處理、堿浸-熱氧化處理、熱氧化-有機(jī)涂層復(fù)合處理和離子鍍鈦等等。本實(shí)驗(yàn)的材料提供方通過對AZ鎂合金（AZ91D）和ME鎂合金（ME20M）在三種不同制備條件下進(jìn)行階躍式微弧氧化表面改性來增加其耐腐蝕性。但改性后鎂合金表面氧化膜的生物相容性如何尚不得知，該性質(zhì)對于其作為醫(yī)用植入材料的應(yīng)用又有著及其重要意義。因此本文擬通過體外實(shí)驗(yàn)來對

3、上述材料的生物相容性進(jìn)行初步的評價。 目的和意義: 通過體外溶血試驗(yàn)和細(xì)胞相容性試驗(yàn)來對經(jīng)過階躍式微弧氧化表面改性過的鎂合金進(jìn)行生物相容性評價；篩選出生物相容性良好的鎂合金材料，為其后期體內(nèi)試驗(yàn)和應(yīng)用于臨床提供一個前期基礎(chǔ)研究；另外，也有利于探討不同制備條件下階躍式微弧氧化與生成的鎂合金表面氧化膜的生物相容性之間的內(nèi)在關(guān)系，從而制備出生物相容性更佳的鎂合金氧化膜材料，為遠(yuǎn)期臨床上內(nèi)植入材料的應(yīng)用提供一個新的選擇。

4、 方法: 1.實(shí)驗(yàn)材料 AZ和ME兩種鎂合金材料分別在三種不同階躍式微弧氧化條件下得到六種鎂合金材料（AZ1、AZ2、AZ3和ME1、ME2、ME3），以及未經(jīng)處理的AZ91D（AZ0）和ME20M（ME0）、高純鎂（H）和鈦合金Ti6Al7Nb（Ti），以上材料均有華南理工大學(xué)提供。先進(jìn)行溶血試驗(yàn)，選擇相容性好的材料再進(jìn)行體外細(xì)胞試驗(yàn)。 2.材料浸提液的制備 浸提介質(zhì)分別采用生理鹽水（用于溶血試驗(yàn)）和

5、含體積分?jǐn)?shù)為0.1的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液（用于細(xì)胞相容性試驗(yàn)），將上述材料按表面積（c㎡）與培養(yǎng)液體積（mL）之比為3：1，加入培養(yǎng)液，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)72h使金屬離子盡可能多的析出，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，制備出材料浸提液。 3.溶血試驗(yàn) 參照國家規(guī)定的最新標(biāo)準(zhǔn)GB/T16886.4-2003來進(jìn)行，將新鮮的抗凝稀釋兔血分別加入10 ml生理鹽水材料浸提液、無菌蒸餾水（陽性對照）、0.9%生理鹽水（陰性對照

6、）之中，37℃水浴中60 min，1000 r/min離心5min。取上清液，用酶聯(lián)免疫檢測儀在540 nm波長測定吸光度值，每組設(shè)5個平行樣品。并按下列公式計(jì)算溶血率：溶血率（%）=（樣品吸光度-陰性吸光度）/（陽性吸光度-陰性吸光度）×100%。 4.大鼠成骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 采用細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)，取出生24h內(nèi)的SD大鼠顱蓋骨組織，分離成骨細(xì)胞，同時進(jìn)行培養(yǎng)及鑒定。 5.細(xì)胞毒性試驗(yàn) 參照國家

7、規(guī)定的最新標(biāo)準(zhǔn)GB/T16886.5-2003來進(jìn)行，將成骨細(xì)胞接種于96孔板上，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁，棄培養(yǎng)液。空白對照組加入單純培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的浸提液（100%、50%、10%、1%），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，然后用MTT法測得的OD值，并將各組OD值轉(zhuǎn)化為細(xì)胞的增值率（細(xì)胞增殖率=材料組OD值/對照組OD值×100%）。根據(jù)細(xì)胞增殖率和細(xì)胞毒性分級（CTG）對應(yīng)的關(guān)系，換算出三種材料不同濃度的細(xì)胞毒

8、性等級。 6.直接細(xì)胞接觸試驗(yàn) 將溶血試驗(yàn)生物相容性好的材料AZ1和AZ3各4塊放入12孔培養(yǎng)板中，將已傳代的成骨細(xì)胞以1×105/ml濃度接種到上述材料上，放入37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。分別于復(fù)合培養(yǎng)后第3d和5d行掃描電鏡觀察。 7.細(xì)胞相容性試驗(yàn) 將成骨細(xì)胞接種于96孔板上，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁，棄培養(yǎng)液。空白對照組加入單純培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同材料的浸提液（AZ1、AZ3和Ti6Al7Nb

9、），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于復(fù)合培養(yǎng)后的第1d、3d、5d分別MTT法檢測細(xì)胞的增殖情況和用堿性磷酸酶（ALP）定量檢測法檢測其細(xì)胞活性。 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，將分別測得的MTT吸光度值和ALP活性各自作3×4析因分析，P<0.05時有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1.溶血試驗(yàn) 上述10種材料中僅有AZ1、AZ3和Ti6Al7Nb的溶血率符合國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)（<5

10、%），分別為2.19%、2.77%和1.33%，符合生物材料的溶血性要求，可以認(rèn)為這三種材料不會引起溶血反應(yīng)。 2.細(xì)胞毒性試驗(yàn) 參照細(xì)胞毒性與細(xì)胞增值率的對應(yīng)關(guān)系，認(rèn)為不同濃度的AZ1、AZ3和Ti6Al7Nb的細(xì)胞毒性均為0級或1級，符合國家規(guī)定的生物材料的細(xì)胞毒性要求。 3.掃描電鏡觀察 發(fā)現(xiàn)材料表面成骨細(xì)胞生長良好，形態(tài)正常，可見成骨細(xì)胞胞體伸長呈長梭形、多邊形或異型形，細(xì)胞表面具有較多的皺褶和微

11、絨毛，細(xì)胞之間伸出偽足互相連接，眾多絲狀和纖維狀突起伸展相互聯(lián)接形成網(wǎng)狀，成骨細(xì)胞在材料表面粘附良好。 4.MTT法檢測及堿性磷酸酶（ALP）檢測 隨培養(yǎng)時間的延長，各組細(xì)胞數(shù)量都有所增加，在同一個時間點(diǎn)上，實(shí)驗(yàn)組之間和實(shí)驗(yàn)組與對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論: 經(jīng)階躍式微弧氧化表面改性生成的鎂合金氧化膜AZ1和AZ3具有很好的生物相容性，不會引起溶血反應(yīng)，與細(xì)胞有很好的黏附性，細(xì)胞相容