胰高糖素樣肽-1對人臍靜脈內皮細胞內皮型一氧化氮合酶的影響及機制的研究.pdf

1、以動脈粥樣硬化為基礎的大血管并發(fā)癥是2型糖尿病的主要并發(fā)癥,是患者致殘、致死的主要原因。其防治是內分泌、心血管及神經等相關學科關注的重點課題。
　　 內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)主要表達于血管內皮細胞,在其催化下合成和釋放一氧化氮(NO)是血管內皮細胞最重要的生理功能之一。作為內皮源性的舒血管因子,NO還具有抗炎、抗氧化、抗凝、抑制血管平滑肌細胞增殖等作用,e

2、NOS催化合成和釋放NO是血管內皮細胞抵御多種致動脈粥樣硬化性損傷的自我保護功能之一。目前的研究發(fā)現(xiàn),2型糖尿病患者體內的多種病理變化可通過引起eNOS活性及表達異常,使NO合成障礙,說明eNOS/NO功能障礙可能是2型糖尿病患者發(fā)生內皮功能異常進而形成動脈粥樣硬化的核心機制之一。
　　 胰高糖素樣肽-1(glucagons like peptide-1,GLP-1)是一種肽類激素,在維持機體糖代謝穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。2型糖尿病

3、患者存在GLP-1分泌缺陷及作用下降,這已經成為公認的2型糖尿病糖代謝紊亂的機制之一,進而以GLP-1為核心的降糖藥物被陸續(xù)研發(fā)并成功的應用于糖尿病的治療。近期的研究發(fā)現(xiàn)GLP-1可引起內皮依賴性的血管舒張;該作用可被eNOS的抑制劑阻斷;輸注GLP-1可使小鼠冠脈血流中NO含量增加。這些研究均提示,GLP-1很可能具有上調eNOS/NO的生理作用。研究GLP-1對內皮細胞eNOS/NO的影響,可以在一定程度上闡明GLP-1發(fā)揮上述血管

4、內皮效應的分子機制。更重要的是,由于eNOS/NO是內皮細胞抗動脈粥樣硬化的主要機制之一,該研究將提示,GLP-1作為一種生理性激素,可能通過對eNOS/NO的調控發(fā)揮內源性的抗動脈粥樣硬化作用,而存在于2型糖尿病患者中的GLP-1分泌缺陷及作用下降,很有可能成為該類患者合并動脈粥樣硬化的機制之一,以GLP-1為核心的治療策略也可能在有效降糖的同時具有直接的抗動脈粥樣硬化作用。
　　 已知,體內存在特異性的GLP-1受體(GLP

5、-1 rcceptor,GLP-1R),GLP-1對糖代謝的調控主要通過存在于胰島、胃腸道和腦組織的GLP-1R介導的信號傳導通路實現(xiàn)。近期的研究發(fā)現(xiàn)在血管內皮細胞也有該受體的表達,提示GLP-1R可能參與介導GLP-1對內皮細胞的調控。值得關注的是,隨著對GLP-1生理作用研究的不斷深入,特別是在近期對其心血管系統(tǒng)作用的研究中,有一些證據表明,體內可能還存在著一種目前尚未知的不依賴于GLP-1R但與GLP-1(9-36)相關的信號通路

6、介導GLP-1的某些生物效應。GLP-1(9-36)是二肽基肽酶Ⅳ(DipeptidylpeptidaseⅣ,DPPⅣ)降解GLP-1形成的代謝產物,因不具有GLP-1R親和力,既往被認為無生物活性。研究發(fā)現(xiàn),在不表達GLP-1R的變異小鼠,GLP-1仍可舒張其腸系膜動脈,用GLP-1(9-36)可以引起與GLP-1相似甚至更強的舒血管作用,而單純的GLP-1R激動劑卻無效;以DPPⅣ抑制劑阻斷GLP-1向GLP-1(9-36)的轉化,

7、可使GLP-1的作用減弱。上述研究提示,在GLP-1對血管內皮細胞的調控中,可能存在兩種信號通路,即GLP-1R依賴性和GLP-1(9-36)相關的非GLP-1R依賴性通路。對于可能存在雙重信號傳導通路這一假設進行證實并對相關問題開展深入的研究,不僅有助于揭示GLP-1發(fā)揮內皮調控作用的分子機制,更重要的是,它提示要全面改善糖尿病患者與GLP-1水平下降相關的病理生理變化,以GLP-1為核心的治療策略須在重視提高GLP-1R激動作用的同

8、時兼顧如何改善非GLP-1R依賴性信號通路的作用,特別是其心血管系統(tǒng)的作用。
　　 目的：
　　 綜上所述,本實驗觀察GLP-1在正常及高糖環(huán)境下對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)NO釋放、eNOS活性及磷酸化水平及其總蛋白和mRNA水平的影響,了解GLP-1對eNOS/NO是否具有上調作用;并進一步觀察GLP-1R及GLP-1(9-

9、36)在其中所起的作用,以明確在GLP-1對eNOS的調控中是否存在雙重信號通路。本課題旨在通過上述研究,為進一步探討2型糖尿病合并動脈粥樣硬化的發(fā)病機制提供新的思路,為以GLP-1為核心,研發(fā)兼具降糖及抗動脈粥樣硬化作用的糖尿病治療藥物提供一點實驗依據。
　　 實驗方法：
　　 1、HUVECs培養(yǎng),在正常葡萄糖濃度(5.5mmol/L)條件下,以含不同濃度GLP-=1的培養(yǎng)液孵育細胞,在不同的時間點收集細胞及培養(yǎng)液,

10、檢測HUVECs的NO釋放、eNOS活性、eNOS1177位絲氨酸磷酸化水平(p-eNOS(ser-1177))、總蛋白和mRNA水平,以了解GLP-1對eNOS/NO的調控作用;在高糖(16.8mmol/L)條件下,以含GLP-1的培養(yǎng)液孵育細胞,在特定時間點收集細胞及培養(yǎng)液,檢測上述指標,以了解高糖環(huán)境是否會影響GLP-1對eNOS/NO的調控;以含相同濃度GLP-1、exenafide(一種GLP-1R激動劑)、GLP-1(9-3

11、6)的培養(yǎng)液分別孵育細胞,在特定時間點收集細胞及培養(yǎng)液,檢測上述指標,再以exendin(9-39)(GLP-1R拮抗劑)和/或sitagliptin(DPPⅣ抑制劑)與GLP-1共同孵育細胞,在特定時間點收集細胞及培養(yǎng)液,檢測上述指標,以了解GLP-1R和GLP-1(9-36)是否均參與GLP-1對eNOS/NO的調控。
　　 2、采用硝酸還原酶法檢測細胞培養(yǎng)液中NO含量,確定HUVECs的NO釋放量。
　　 3、采用

12、NOS檢測試劑盒(熒光法),應用熒光酶標儀檢測HUVECs內eNOS活性。
　　 4、采用Western blot法檢測HUVECs內p-eNOS(ser-1177)、總eNOS蛋白表達。
　　 5、應用real time RT-PCR技術檢測eNOS mRNA的表達。
　　 結果：
　　 1、在正常葡萄糖geN(5.5 mmol/L)條件下,50-5000pM的GLP-1可使HUVECs的NO釋放增加(

13、P＜0.05),eNOS活性提高(P＜0.05),且有量效關系;500-5000pM的GLP-1可提高HUVECs內p-eNOS(Ser-1177)水平(P＜0.05),5000pM的GLP-1可提高HUVECs內總eNOS蛋白水平(P＜0.05),但對eNOS mRNA水平無影響(P＞0.05)。
　　 2、在高糖(16.8mmol/L)條件下,GLP-1仍可增加HUVECs的NO釋放(P＜0.05),提高eNOS活性(P＜0

14、.05),提高HUVECs內p-eNOS(ser-1177)水平(P＜0.05)、總eNOS蛋白水平(P＜0.05),而且還可提高HUVECs內eNOS mRNA水平(P＜0.05)。
　　 3、與GLP-1相似,5000pM的exenatide或GLP-1(9-36)均可提高HUVECs的NO釋放、eNOS活性、p-eNOS(ser-1177)水平、總eNOS蛋白水平(P＜0.05)。在高糖條件下,exenatide可提高eN

15、OS mRNA水平(P＜0.05),但GLP-1(9-36)對其水平無影響(P＞0.05)。
　　 4、GLP-1R拮抗劑或DPPⅣ抑制劑或兩者同時作用,均只能部分阻斷GLP-1對HUVECs的NO釋放、eNOS活性、p-eNOS(ser-1177)水平、總eNOS蛋白水平的影響(P＜0.05),GLP-1R拮抗劑的存在可完全阻斷高糖條件下GLP-1對eNOSmRNA水平的影響(P＜0.01),DPPⅣ抑制劑對其無影響(P＞0.

16、05)。
　　 結論：
　　 1、GLP-1對體外培養(yǎng)的HUVECs具有上調其eNOS活性及表達,進而增加其NO釋放的作用,提示作為參與血糖調控的生理性激素,GLP-1可能在維持血管內皮正常功能中發(fā)揮作用。2型糖尿病患者存在的GLP-1分泌缺陷可能是其并發(fā)動脈粥樣硬化的機制之一。
　　 2、高糖環(huán)境不影響GLP-1對HUVECs的eNOS/NO的上調作用,提示以GLP-1為核心的降糖藥物可對糖尿病患者發(fā)揮改善血管