ADSCs在體內(nèi)-外環(huán)境下的生物學(xué)效應(yīng)研究.pdf

1、2001年Zuk等人首次從人體內(nèi)的脂肪組織中分離得到了脂肪來源的成體干細胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs),并進行了體外分離、培養(yǎng)和傳代。目前,已證實ADSCs是一類具有多向分化潛能中胚層來源的干細胞,可誘導(dǎo)分化為骨、軟骨、脂肪、骨骼肌和神經(jīng)等細胞,已成為近年來再生醫(yī)學(xué)研究的熱點之一。ADSCs具有組織相容性好、低免疫原性、多向分化潛能強、含量豐富、取材容易,給患者帶來的痛苦小,研究和應(yīng)用時不涉及倫理等優(yōu)

2、勢,已作為優(yōu)良的種子細胞,應(yīng)用于組織損傷修復(fù)、免疫細胞治療和抗腫瘤基因治療等領(lǐng)域,在臨床治療中有廣泛的應(yīng)用前景。
　　然而,同其他成體干細胞一樣,ADSCs的培養(yǎng)也不可避免的遇到一個關(guān)鍵問題,即體外培養(yǎng)過程中ADSCs逐漸老化甚至腫瘤化。主要表現(xiàn)在ADSCs傳代過程中其增殖能力逐漸減弱,并可能喪失其多向分化潛能,一般認為體外培養(yǎng)60代以上可能會轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細胞。ADSCs在體外大量擴增導(dǎo)致其增殖分化能力降低,從而限制了其臨床應(yīng)用且具

3、有難以預(yù)料的生物安全性風(fēng)險。令人感興趣的是:體內(nèi)存活的ADSCs以及其他成體干細胞可以長時間保持干細胞特性,而體外培養(yǎng)環(huán)境下的成體干細胞卻出現(xiàn)上述結(jié)果,什么因素觸發(fā)了體外培養(yǎng)干細胞的轉(zhuǎn)變?而又是什么因素維持著體內(nèi)生存的細胞干性呢?
　　關(guān)于體內(nèi)外微環(huán)境方面,近年來國內(nèi)外的研究主要集中在:改良生長添加劑,包括將胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)替換成人AB異種血清和凝血酶活化的富含血小板的血清,能夠增強間充質(zhì)干細胞

4、的成骨、成軟骨和成脂分化能力,同時又有促進其增殖作用;添加生長因子,即在無血清的培養(yǎng)基中添加各種生長因子來提高ADSCs的分化潛能;細胞外基質(zhì)培養(yǎng)基,有學(xué)者認為在體外培養(yǎng)時容易喪失干細胞特性,緣于離開了其生長的特定微環(huán)境,因此將干細胞培養(yǎng)在其來源的細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)中發(fā)現(xiàn),這種ECM有利于干細胞的增殖,并能抑制其自發(fā)性分化;生物反應(yīng)器,即模擬體內(nèi)的生長條件,選擇適合哺乳類動物細胞生長的因素培養(yǎng)細

5、胞,觀察其增殖和分化能力;還有學(xué)者采用中藥成分進行研究。
　　微環(huán)境誘導(dǎo)分化學(xué)說指出,在干細胞生存的微環(huán)境中可能存在影響分化潛能的某種因子,即在特定的體內(nèi)微環(huán)境中,干細胞通過與各種細胞因子、激素、細胞基質(zhì)及其他細胞的相互作用,導(dǎo)致調(diào)控干細胞分化的關(guān)鍵基因表達,以決定分化潛能。
　　由于體內(nèi)的微環(huán)境在體外條件下極難完全模擬,根據(jù)以上理論,我們通過“體內(nèi)生物反應(yīng)器”將ADSCs植入其來源的動物大網(wǎng)膜微環(huán)境中,對比觀察體內(nèi)體外培養(yǎng)

6、的干細胞生物學(xué)特性和干性基因的改變,并采用質(zhì)譜分析的方法對體內(nèi)相關(guān)生長因子進行了初步分析,以期探索體內(nèi)環(huán)境中對其干性影響的因素,為改良培養(yǎng)基奠定基礎(chǔ)。
　　主要工作和結(jié)果:
　　1.實驗中采用了“改良Ⅰ型膠原酶法”分離和純化SD大鼠ADSCs,經(jīng)過體外培養(yǎng),傳代擴增,建立了體外分離、培養(yǎng)和擴增ADSCs的高效、穩(wěn)定、簡單的方法;經(jīng)成骨、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng),并通過油紅O染色和茜素紅染色鑒定證實,體外培養(yǎng)的ADSCs具有成骨、成脂肪分

7、化的潛能,采用流式細胞儀測定ADSCs表面標志物,符合ADSCs生物學(xué)特性,能夠滿足進一步研究和應(yīng)用的需要。
　　2.本研究中設(shè)計并制備了適于體內(nèi)培養(yǎng)ADSCs的生物反應(yīng)器,通過物理測試、小分子滲透測試、細胞滲透實驗和體內(nèi)生存測試,證實該生物反應(yīng)器能夠有效保障ADSCs在體內(nèi)生存所需的條件。
　　3.通過對比體內(nèi)和體外培養(yǎng)ADSCs的生物學(xué)特性和干性基因OCT4、NANOG、SOX2的表達,證實體內(nèi)微環(huán)境更有利于維持干細胞干

8、性。
　　4.采用納升級超高壓液相色譜和電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對生物反應(yīng)器內(nèi)體液進行分析,和常規(guī)培養(yǎng)基進行對比,篩選差異蛋白,初步認為IGFs可能是影響分化潛能的因素之一。
　　5.本實驗中,將rhVEGF165轉(zhuǎn)染到第3代穩(wěn)定生長的ADSCs,并通過生物反應(yīng)器植入體內(nèi),經(jīng)分子生物學(xué)和組織病理學(xué)檢測證實,ADSCs作為外源性rhVEGF165基因治療平臺更有利于發(fā)揮體內(nèi)緩釋作用,促進皮下組織血管的生成。
　　6.通過共培養(yǎng)