BafilomycinA1對鈷納米顆粒所致體內(nèi)外不良生物學(xué)效應(yīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分Bafilomycin A1抑制鈷納米顆粒誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒性和促炎細(xì)胞因子的釋放的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：研究Bafilomycin A1對鈷納米顆粒（CoNPs）誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒性和炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用。
　　方法：
　?。?）采用不同濃度的CoNPs、Co2+和Bafilomycin A1對RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行甲基噻唑基四唑（Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法

2、檢測細(xì)胞生存率；
　?。?）通過對照組、CoNPs組、低劑量藥物組、高劑量藥物組四組 MTT分析方法檢測細(xì)胞生存率比較，評估Bafilomycin A1對CoNPs細(xì)胞毒性的抑制作用；
　?。?）采用 DAPI對RAW264.7細(xì)胞核進(jìn)行染色，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞數(shù)量的變化；
　　（4）掃描電鏡觀察各組RAW264.7細(xì)胞超微形態(tài)學(xué)的變化；（5）采用ELISA法檢測前炎癥因子TNF-α、IL-1β、 IL-6的表達(dá)情況。

3、
　　結(jié)果：
　?。?） CoNPs及 Co2+對RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)呈現(xiàn)時(shí)間、濃度依賴性；Bafilomycin A1（8nM，16nM）對RAW264.7細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性；CoNPs和Co2+細(xì)胞毒性的起效濃度分別約為50、400μM；
　?。?）隨著Bafilomycin A1作用濃度的增高 RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性逐漸減弱（P<0.05）；
　?。?）熒光顯微鏡觀察隨著Bafilomy

4、cin A1作用濃度的增高RAW264.7細(xì)胞數(shù)量逐漸增加；
　?。?）掃描電鏡觀察顯示CoNPs組的RAW264.7細(xì)胞偽足基本消失，且細(xì)胞明顯縮小；隨著Bafilomycin A1作用濃度的增高RAW264.7細(xì)胞的偽足逐漸增多，且細(xì)胞鋪展面積逐漸與對照組接近；
　?。?）隨著 Bafilomycin A1作用濃度的增高炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)逐漸減弱（P<0.05）。
　　結(jié)論：CoNPs對R

5、AW264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)強(qiáng)于 Co2+；Bafilomycin A1（8nM，16nM）沒有細(xì)胞毒性。Bafilomycin A1對CoNPs所致RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性和炎癥反應(yīng)具有保護(hù)作用。
　　第二部分Bafilomycin A1抑制鈷納米顆粒誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：研究探索Bafilomycin A1對CoNPs誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分化的影響。
　　方法：

6、>　　（1） RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)第5d，通過倒置相差顯微鏡觀察活體破骨細(xì)胞形態(tài)改變、TRAP染色、TRAP染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)上來評估Bafilomycin A1抑制CoNPs誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的作用；
　?。?）培養(yǎng)第6d通過 Real-time PCR檢測破骨細(xì)胞基因表達(dá)從基因水平來評估Bafilomycin A1抑制CoNPs誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的作用。
　　結(jié)果：
　?。?）培養(yǎng)第

7、5d，通過倒置相差顯微鏡觀察，CoNPs組不規(guī)則細(xì)胞數(shù)量增加，體積增大，多核細(xì)胞亦增多，其內(nèi)的細(xì)胞核也增多。隨著 Bafilomycin A1作用濃度的增加，多核細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，多核細(xì)胞體積逐漸變?。煌ㄟ^TRAP染色，CoNPs組有大量TRAP染色陽性的破骨細(xì)胞形成，隨著Bafilomycin A1作用濃度的增加，TRAP染色陽性的破骨細(xì)胞數(shù)目逐漸減少（p<0.05）。
　?。?）培養(yǎng)第6dReal-time PCR檢測破骨細(xì)胞

8、基因TRAP、RANK及Cath-K的表達(dá)，所得結(jié)果規(guī)律性與活體破骨細(xì)胞形態(tài)改變、TRAP染色結(jié)果一致。
　　結(jié)論：小鼠RAW264.7細(xì)胞能夠被RANKL誘導(dǎo)生成破骨細(xì)胞，CoNPs能夠加速誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，Bafilomycin A1能夠抑制CoNPs誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的進(jìn)程，呈劑量依賴性。
　　第三部分Bafilomycin A1對鈷納米顆粒誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞不良生物學(xué)效應(yīng)保護(hù)作用的機(jī)制研究
　

9、　目的：研究 pH值對CoNPs溶解的影響，通過H+-ATPase抑制劑Bafilomycin A1抑制RAW264.7對細(xì)胞內(nèi)的CoNPs溶解的影響、TEM超微結(jié)構(gòu)改變及氧化應(yīng)激水平的影響，初步探討B(tài)afilomycin A1對CoNPs所致體內(nèi)外不良生物學(xué)效應(yīng)保護(hù)作用的機(jī)制。
　　方法：
　　（1）通過ICP-MS測量 CoNPs在不同 pH值培養(yǎng)基中釋放 Co2+的水平；
　?。?）各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞通過 ICP-MS

10、測量及 EDX能譜測試，評估Bafilomycin A1抑制細(xì)胞內(nèi)CoNPs溶解作用；
　?。?）利用TEM觀察各組RAW264.7細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變；
　?。?）收集各組RAW264.7細(xì)胞抽提液，通過GSH/GSSG、SOD、CAT、GPx水平檢測，評估 Bafilomycin A1抑制細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的作用。
　　結(jié)果：
　?。?）培養(yǎng)基中離子釋放呈現(xiàn)時(shí)間、pH值依賴關(guān)系，各時(shí)間點(diǎn)釋放的濃度均小于 Co2+細(xì)

11、胞毒性起效濃度；
　?。?）細(xì)胞內(nèi) CoNPs離子釋放呈現(xiàn)時(shí)間依賴關(guān)系，隨著Bafilomycin A1作用濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)CoNPs離子釋放逐漸減少（P<0.05）；
　　（3）CoNPs組RAW264.7細(xì)胞內(nèi)溶酶體和濾泡的數(shù)目急劇增多，CoNPs被溶酶體吞噬，伴有細(xì)胞器消失；隨著Bafilomycin A1作用濃度的增高，RAW264.7細(xì)胞內(nèi)溶酶體和濾泡的數(shù)目逐漸減少，同時(shí)消失的細(xì)胞器再次出現(xiàn)；
　　（4）C

12、oNPs組 GSH、SOD、GPx、CAT水平明顯降低，隨著Bafilomycin A1作用濃度的增高，GSH、SOD、GPx、CAT水平相應(yīng)升高。
　　結(jié)論： CoNPs的溶解度在細(xì)胞外環(huán)境中很低，在細(xì)胞內(nèi)低 pH值環(huán)境的溶酶體中更容易溶解釋放大量鈷離子，從而破壞細(xì)胞抗氧化防御機(jī)制，引起氧化應(yīng)激損傷，是CoNPs引起細(xì)胞毒性反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化等一系列不良生物學(xué)反應(yīng)的根本原因。
　　第四部分Bafilomyci

13、n A1抑制鈷納米顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨周圍急性炎癥反應(yīng)和骨溶解作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：研究Bafilomycin A1對CoNPs誘導(dǎo)的小鼠顱骨周圍急性炎癥反應(yīng)和骨溶解作用的影響。
　　方法：
　?。?）建立小鼠顱骨周圍急性炎癥反應(yīng)和骨吸收注射模型，各組顱骨周圍軟組織病理學(xué)切片染色觀察及炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)分析；
　?。?）各組顱骨病理學(xué)切片染色觀察及骨組織計(jì)量學(xué)數(shù)據(jù)測量；
　?。?）各組 Micro-CT分析；（

14、4）各組顱骨周圍軟組織促炎細(xì)胞因子的測量。
　　結(jié)果：
　　（1）顱骨周圍軟組織病理學(xué)切片染色觀察及炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)分析結(jié)果提示CoNPs組細(xì)胞浸潤最密集，滿視野均是核染成深藍(lán)色巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞，隨著 Bafilomycin A1作用濃度的增加，炎性細(xì)胞浸潤數(shù)目逐漸減少（p<0.05）。
　　(2)顱骨病理學(xué)切片染色觀察及骨組織計(jì)量學(xué)數(shù)據(jù)測量結(jié)果提示CoNPs組的樣本可見顱骨骨吸收明顯，伴炎性細(xì)胞浸潤。隨著 Bafilo

15、mycin A1作用濃度的增加，骨吸收破壞范圍減小，溶解面積減小，炎性細(xì)胞浸潤數(shù)目逐漸減少。
　　(3)Micro-CT分析結(jié)果提示CoNPs組骨吸收明顯、隨著Bafilomycin A1作用濃度的增加，骨吸收破壞范圍減小。隨著Bafilomycin A1作用濃度的增加BMD和BMC顯著升高(P<0.05)。
　?。?）顱骨周圍軟組織促炎細(xì)胞因子表達(dá)結(jié)果提示 CoNPs組軟組織內(nèi) TNF-α、IL-1β及 IL-6蛋白表達(dá)量